不同LED 红、蓝光质组合对番茄灰霉病防御机制的影响

陈彦杞，张 涛，刘勇鹏，任子君，闫颖捷

（1.河南省农业技术推广总站 郑州 450002；2.河南农业大学 郑州 450002；3.漯河市农业科学院 河南漯河462000；4.河南省农业科学院 郑州 450002；5.河南睢县农业科学研究所 河南睢县 476900）

番茄灰霉病菌是设施番茄栽培生产中发生较为普遍的一种病原真菌，是当前日光温室越冬、塑料大棚早春番茄生产上最重要的病害之一，一般发病较轻时能造成的经济损失在25%左右，发病严重时可达70%[1]，甚至绝收，目前防治方法还是以化学农药防治为主。但是随着人们生活质量的提高，对蔬菜需求更多为高品质、无污染的绿色有机蔬菜。所以近年来通过对温室内光、温、水、气体等环境因素的调控来达到防治病害的目的已成为温室生产研究的热点课题[2]。其中随着半导体产业的快速发展，LED 人工可见光作为一种无污染的新型物理防治技术措施，也开始在防治植物重要病害上得到应用[3]。Shirasawa 等[4]通过试验研究发现，红光能很好地抑制水稻稻瘟病细胞的菌丝生长，从而减少水稻稻瘟病病原菌对水稻的侵染和伤害。Yu 等[5]研究表明，相比蓝光处理条件下，红、蓝光处理下辣椒炭疽病菌丝生长相对较为缓慢，分生孢子和芽管与其他处理条件下差异也比较大。Liao 等[6]研究也发现，柑橘绿霉、青霉及酸梅病菌在低光照度（40 μmol·m-2·s-1）处理下，病原菌菌丝生长与黑暗处理条件下无明显差异，而当光照度增加到120 μmol·m-2·s-1时，才能够有效抑制菌丝生长。Parada等[7]研究显示，红光光照12 h 的处理，水稻褐斑病菌的感染面积明显少于对照处理，红光处理48 h 的处理，病斑侵染面积也基本没有再扩大。付雁南[8]研究发现，光周期10～12 h·d-1的紫光和红光处理组比其他时长的抑菌效果更为明显，番茄灰霉病病斑扩展的面积也相对比较小。

当前LED 光源作为新型节能光源，具有光谱广泛、耗能少、发热少和寿命长等优点，被越来越多地应用于温室作物生产中[9-11]。但由于LED 在农业上的应用刚刚开始，对LED 在植物抗病性方面的作用研究较少且主要集中于单一光质和光周期上，在组合光质研究上并不深入，抗病现象产生的具体机制研究比较少。因此，笔者以番茄灰霉病菌为研究对象，在前人研究的基础上[6-8]，在LED 光照度为200 μmol·m-2·s-1、光周期为12 h·d-1的情况下，研究了不同红蓝光质配比的光环境条件对番茄灰霉病侵染的影响，并通过检测抗氧化酶活性及脯氨酸、丙二醛含量的变化了解光环境对番茄叶片防御机制的影响，探究LED 影响番茄灰霉病致病性的生理机制，为在温室番茄生产中通过红蓝组合光环境条件抑制灰霉病发生和发展提供重要理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采用常见栽培番茄品种Money Maker。供试灰霉病菌株由河南农业大学植物保护学院提供，从当地温室内感染灰霉病的番茄植株上分离鉴定得到，在PDA 培养基上25 ℃条件下继代培养，待用。试验照明设备采用广东三雄极光股份有限公司生产的LED 灯。

1.2 试验设计

试验于2020 年8 月至2021 年1 月在河南省郑州市河南农业大学2 号楼人工气候室中进行。通过设置全LED 光照人工气候箱，调节不同的LED 红、蓝光质配比（由红色与蓝色LED 光按照不同比例组合获取），分别为红光∶蓝光（R∶B）=1∶1、红光∶蓝光（R∶B）=3∶1、红光∶蓝光（R∶B）=5∶1 和白光，分别简写为A、B、C 和D，同时以黑暗条件作为对照（CK）处理，共5 个处理。分别调节人工气候箱的温、湿度做菌丝生长试验和离体番茄叶片灰霉病菌接种侵染试验。

1.3 方法

1.3.1 灰霉菌丝生长试验 选取致病性较强的菌株，从原始菌落中转移到PDA 培养基上培养，待菌落长至50～60 mm 时从菌落边缘打取d=5 mm 的菌片接种到新的PDA 培养基中央。培养基放置到人工培养箱内，分别调节4 种光质LED 灯进行照射，同时以黑暗条件下培养的菌落为对照（CK）。通过调节LED 光源与PDA 平板距离及电流光强控制器，使其表面处的光照度稳定为200 μmol·m-2·s-1，光周期设置为12 h·d-1。人工气候室温度和相对湿度分别为（23±1）℃和90%。按照随机区组设计，每个处理接种60 株，每个处理3 次重复，接种1 d后，每12 h 测量菌落直径，每个重复取样20 株，共记录5 d。

1.3.2 离体番茄叶片灰霉病菌接种侵染试验 选取生长期间长势相同的番茄叶片，用蒸溜水清洗干净。筛选出最适病菌孢子悬浮液浓度（106 CFU·mL-1），在番茄叶上进行针刺接种灰霉病菌孢子悬浮液（106 CFU·mL-1，5 μL·伤口-1，3 个伤口·颗-1），做灰霉病侵染的试验。将接种了灰霉病菌的番茄叶片置于调好温度（23±1）℃和湿度（90%）的人工气候箱中，人工气候箱中安装4 种红、蓝光质配比的LED 灯，光周期设置为12 h·d-1。按照随机区组设计，每个处理接种60 片，每个处理3 次重复，接种1 d 后，每12 h测量1 次，每个重复取样20 片叶片，测病斑直径，共记录3 d。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 菌丝生长抑制率和病斑扩展抑制率测定方法 使用游标卡尺测量菌落生长直径，并用下列公式计算菌丝生长抑制率和病斑扩展抑制率。

1.4.2 番茄叶片酶活性指标的测定 在对番茄叶片接种灰霉病后，在不同LED 光质处理下，每隔12 h 开始取叶片样品，样品均为接种成功并已经侵染的叶片，共记录3 d，取3 次。然后对不同处理下的叶片样品进行保护酶活性等及MDA、脯氨酸含量的测定。根据Huo 等[12]方法测定SOD、POD 和CAT 活性；参照《植物生理生化实验原理与技术》[13]测定PAL 酶活性、脯氨酸和MDA 含量。试验随机取样，所有指标测定均3 次重复。

1.5 数据处理

采用WPS 2021 软件进行数据统计整理，采用SPSS20.0 软件进行方差分析，采用Sigmaplot14.5软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同LED 组合光质对番茄灰霉病菌丝生长的影响

由图1 可知，不同LED 红蓝组合光质处理后番茄灰霉病菌丝直径均与对照存在显著差异。其中前2 d，不同红、蓝光质配比的菌落直径之间均存在显著差异，以C 光质配比处理下菌丝生长直径最小，其菌丝抑制率分别为49.06% 和61.37%，其次是B 处理，菌丝抑制率分别为45.66% 和56.27%；第3 天时，A 光质处理与B 处理间菌落直径无显著差异，仍以C 处理菌丝抑制率最高，为65.63%；第4天时，A、B、C 处理之间菌落直径差异不显著，但均与D（白光）处理及对照之间差异显著，A、B、C 和D处理菌丝抑制率分别为36.24%、36.44%、37.34%和18.72%；第5 天时，A、B、D（白光）光质处理之间菌落直径差异不显著，但与C（红、蓝5∶1）处理存在显著性差异，其中C（红、蓝5∶1）处理菌丝抑制率最高，为29.81%。综上可知，不同红蓝光质配比对番茄灰霉病菌丝的生长均有一定的抑制作用，但随着培养时间的延长，抑制作用越来越弱。此外随着红光比例的增加，抑制作用也越来也强，C 处理下抑制作用最强。

2.2 不同LED 组合光质对离体番茄叶片灰霉病侵染的影响

由表1 可知，在离体番茄叶片接种灰霉病菌后的前2 d 内，4 种不同红、蓝光质配比下，番茄灰霉病病斑直径与对照均存在显著差异。在接种1 d 后时，以C 光质配比处理下病斑最小，病斑抑制率为79.88%，其次是B（红、蓝3∶1）处理，病斑抑制率为52.77%，A、D 处理病斑抑制率分别为31.29% 和51.80%。在接种2 d 时，各处理病斑抑制率分别为17.65%、35.69%、56.98%、15.23%；在接种3 d 后，各处理病斑抑制率分别为5.54%、9.93%、20.78%、8.44%，其中A（红、蓝1∶1）处理与对照相比差异不显著，仍以C（红、蓝5∶1）处理下病斑抑制率最高。综上可知，不同红、蓝光质配比对番茄灰霉病的侵染均有一定的抑制作用，其中随着红光比例的增加，抑制作用整体表现也越来也强，说明在LED 红、蓝组合配比光质中，适当的增加红光比例有利于抑制番茄灰霉病菌的侵染。

表1 不同LED 组合光质对离体番茄叶片灰霉病侵染的影响

2.3 不同LED 组合光质对离体番茄叶片接种灰霉病后SOD活性的影响

由图2 可知，在离体番茄叶片接种灰霉病菌1 d 后，4 种不同红、蓝光质配比处理下，B、C、D 处理下番茄叶片中SOD 活性与对照相比差异显著，以C 光质配比处理下SOD 活性最高，比对照提高54.10%，其次是D（白光）处理，比对照高51.95%，A、B 处理分别比CK 高6.45% 和29.83%。在接种2 d 后，4 种不同红蓝光质配比处理下，SOD 活性与对照相比均有一定增强作用，其中C、D 处理之间无显著性差异但均与其他处理存在显著性差异，各处理比CK 分别高22.86%、46.42%、69.48%、68.79%；在接种3 d 后，各处理以B、C、D 处理与CK 相比存在显著差异，但仍以C 光质配比处理下SOD 活性最高，比CK 高23.31%，也显著高于其他处理。综上可知，不同红、蓝光质配比下，离体番茄叶片中SOD 活性随着红光比例的增加，越来越高，说明在LED 组合配比光质中，适当地增加红光比例有利于抑制番茄灰霉病菌的侵染，整体以红、蓝为5∶1 情况下最能提高番茄叶片中SOD 活性。

图2 不同LED 组合光质对离体番茄接种灰霉病后SOD 活性的影响

2.4 不同LED 组合光质对离体番茄叶片接种灰霉病后POD活性的影响

由图3 可知，在离体番茄叶片接种灰霉病菌1 d 后，与对照相比，4 个不同红、蓝LED 光质配比处理下番茄叶片过氧化物酶活性均有所升高。其中，A、B 处理番茄叶片过氧化物酶活性均与对照差异不显著，C 处理下叶片过氧化物酶活性最高，比对照显著提高69.35%；其次是D 处理，比对照显著提高33.79%。在离体番茄叶片接种灰霉病菌2 d 后，仍以C 处理番茄叶片过氧化物酶活性最强，比对照显著提高76.86%；其次是D 处理，比对照显著提高36.09%。在离体番茄叶片接种灰霉病菌3 d 后，4个处理番茄叶片过氧化物酶活性均与对照存在显著差异，表现最好的依然是C 光质处理，比对照提高47.25%；其次是D 处理，亦与对照存在显著差异，但与A 和B 处理之间均不存在显著性差异，比对照提高24.28%；A、B 处理分别比对照提高22.72%、23.53%。综上可知，在离体番茄叶片接种灰霉病菌1、2、3 d 后试验数据的统计中，不同光质配比处理下，番茄叶片中过氧化物酶活性以C（红、蓝5∶1）处理最高。

图3 不同LED 组合光质对番茄接种灰霉病后POD 活性的影响

2.5 不同LED 组合光质对离体番茄叶片接种灰霉病后CAT活性的影响

由图4 可知，在离体番茄叶片接种灰霉病菌1 d 后，4 个光质配比处理下B、C、D 处理CAT 活性与对照有显著差异，分别比对照提高31.55%、43.76%、37.43%；仅A 处理与对照相比差异不显著，比对照提高9.60%。在离体番茄叶片接种灰霉病菌2 d 后，各个处理CAT 活性均与对照存在显著差异，以C 处理下CAT 活性最高，比对照提高50.14%；其次是B、D 处理，分别比对照高33.06%、40.29%；其中B、D 处理之间无显著差异，但均与A 处理存在显著差异。在离体番茄叶片接种灰霉病菌3 d 后，以C 处理效果最显著。A、B 处理与对照相比差异不显著。综上所述，在番茄生长期内叶片中保护酶过氧化氢酶活性，以C 光质处理最高，增效最好，其次是D 处理。整体表明适当地增加红光比例有利于提高番茄叶片中CAT 活性。

图4 不同LED 组合光质对番茄接种灰霉病后CAT 活性的影响

2.6 不同LED 组合光质对离体番茄叶片接种灰霉病后PAL活性的影响

由图5 可知，在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌1 d 后，不同LED 光质配比处理下番茄离体叶片中PAL 活性与对照相比均存在显著差异，其中C、D处理与A、B 处理之间也存在显著差异，但C、D 处理之间及A、B 处理之间无显著性差异；各处理中以C 处理下PAL 活性最强，比对照提高61.87%，其次是D 处理，比对照提高60.91%。在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌2 d 后，各处理PAL 活性分别比对照提高12.88%、17.75%、76.53%、47.34%；其中A处理与对照相比差异不显著，其他处理之间均存在显著性差异，且与对照也存在显著差异。在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌3 d 后，以C、D 处理相比对照差异显著，分别比对照提高128.71%、120.06%；其次是B 处理，相比对照提高61.27%。综上分析可得，在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌3 d 内，不同红蓝LED 光质配比处理中PAL 活性以C 处理相比对照最高，效果表现最好，其次是D处理。

图5 不同LED 组合光质对番茄接种灰霉病后PAL 活性的影响

2.7 不同LED 组合光质对离体番茄叶片接种灰霉病后脯氨酸（Pro）含量的影响

由图6 可知，在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌1 d 后，不同光质配比处理下离体番茄叶片中脯氨酸含量与对照相比均有显著提高，以C 处理最高，比对照增加29.10%；其次是B、D 处理，其中C、B 处理之间差异不显著，B、D 处理之间差异不显著。在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌2 d 后，不同LED 红、蓝光质配比处理之间仍以C 处理效果最好，相比对照增加35.13%；其次是D 处理，相比对照增加32.61%，其中，A 处理与对照之间差异不显著，其他处理与对照均存在显著差异，C、D 处理之间差异不显著。而在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌3 d 后，各个处理相比对照分别增加1.61%、11.16%、30.29%、21.00%。整体分析而言，在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌3 d 内，不同LED 红、蓝光质配比处理中C 处理相比其他处理脯氨酸含量增加最显著，其次是D 处理。此外A 处理除在第1 d 时与对照存在差异外，其他时间与对照差异均不显著，说明增加一定的红光比例有利于提高番茄叶片中脯氨酸的含量。

图6 不同LED 组合光质对番茄接种灰霉病后脯氨酸含量的影响

2.8 不同LED 组合光质处理对离体番茄叶片接种灰霉病后丙二醛含量的影响

由图7 可知，在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌1 d 后，不同光质设置的4 个处理丙二醛含量均与对照存在显著差异，分别比对照降低13.90%、33.39%、35.21%、34.40%，其中B、C、D 处理之间差异不显著。在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌2 d后，4 个处理丙二醛含量相比对照分别显著降低5.17%、16.85%、24.39%、22.29%。在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌3 d 后，4 个处理丙二醛含量均与对照相比差异不显著，分别比对照降低3.01%、5.03%、7.41%、4.47%。整体分析可知，在离体番茄叶片接种番茄灰霉病菌3 d 内，不同LED 红、蓝光质配比处理中对番茄叶片中丙二醛含量均有一定的降低效果，其中随着时间的延长，降低效果越来越弱，但整体仍以C 处理的降低作用较好，效果最为明显。

图7 不同LED 组合光质对番茄接种灰霉病后MDA 含量的影响

3 讨论与结论

光是植物成长发育过程中非常重要的环境因素之一，不但影响植物的生长发育，对病原菌生长也至关重要。近年来，随着半导体技术快速发展，LED 灯具有节能、简易、高效、环保、稳定、按需补光、按需组合等优点，使其在温室作物上的应用也成了国内外研究者的关注热点，尤其在补光栽培和提高植物逆境胁迫抗性方面[14]。

前人研究发现，可见光对病原菌真菌的形态形成具有重要的影响，可直接影响病原菌的分生孢子、分生孢子生殖管、菌核、子实体等的发育[3]。Sánchez-Murillo 等[15]研究表明，蓝光照射条件下能够促进Paecilomyces fumosoroseus和Trichoderma atroviride孢子的形成。Yu 等[5]研究表明，相比蓝光、白光和黑暗处理，红光和绿光条件处理更能显著抑制辣椒炭疽病菌丝直径的生长。也有研究结果表明，相比红光和黄光，紫光和蓝光能够更好地抑制灰霉病菌丝生长[8]。Ondrusch 等[16]研究发现，可见光可以抑制引起新鲜果蔬腐烂污染的Listeria monocytogenes真菌的生长；Rahman 等[17]研究发现，红光能够抑制蚕豆的叶斑病和水稻的胡麻斑病菌丝的生长等。笔者通过研究不同LED 红、蓝光质配比对番茄灰霉菌丝生长的影响，发现不同LED 红、蓝光质配比对番茄灰霉病菌丝的生长均有一定的抑制作用，随着红光比例的增加，抑制作用越来越强。Liao 等[6]的研究也表明，蓝光能有效抑制柑橘指状青霉和意大利青霉菌丝生长。Casas 等[18]发现红光照射下，木霉菌（Trichoderma atroviride）菌丝生长受到抑制等。本文结果与这些研究结果相近。

研究表明，不同LED 红、蓝光质对植物的抗病性均有不同的影响[19]。Kim 等[20]研究发现，在蓝光下，番茄灰霉病受到抑制。杨哲[21]研究发现，红光也能提高番茄叶片对灰霉病的抗性，抑制番茄灰霉病的发展。也有研究结果表明，红光能够抑制植物蚕豆灰霉病、黄瓜褐斑病等多种真菌病害的侵染。笔者研究发现，不同红、蓝光质配比对番茄灰霉病的侵染均有一定的抑制作用，适当地增加红光比例有利于抑制番茄灰霉病菌的侵染，这与前人[21]的研究结果相一致。在生理防御方面，前人研究发现，红光处理能显著提高番茄叶片的SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）和POD（过氧化物酶）这3种抗氧化保护酶的活性，其中红、蓝组合光下SOD活性相对最高[17]。宁宇[22]研究表明，在红光或蓝光条件下，韭菜的SOD 活性显著高于白光。张晓梅等[23]研究发现，黄瓜幼苗在红光处理下抗氧化酶活性高于其他处理。笔者研究发现，适当地增加红光比例有利于提高植物的抗氧化酶活性和脯氨酸含量，其中以红、蓝为5∶1 情况下最能提高番茄叶片中SOD、POD、CAT、PAL 活性和脯氨酸含量，这与前人的研究结果一致。

综上可知，在不同LED 红、蓝光质配比中，不同红蓝光质配比对番茄灰霉病菌丝的生长和侵染均有一定的抑制作用，但随着培养时间的延长，抑制作用越来越弱，而随着红光比例的增加，抑制作用却越来也强，整体以C（红、蓝5∶1）处理下菌丝生长抑制作用最强，病斑抑制率最高。在生理防御上，不同红、蓝光质配比下，离体番茄叶片中SOD、POD、CAT、PAL 活性随着红光比例的增加，表现越来越强，相比对照差异显著，效果表现最好。而不同LED 红、蓝光质配比处理对番茄叶片中丙二醛含量均有一定的降低效果，仍以C（红、蓝5∶1）处理的降低效果较好，效果最为明显。整体可知，LED 红、蓝为5∶1 光质是对设施番茄灰霉病防治最为有利的光配比。

笔者试验只开展了离体叶片接种灰霉病菌后在不同LED 光质配比下的研究，后续还需要做进一步的活体接种试验，加以论证和研究。伴随着LED光照技术在设施蔬菜产业上的快速应用，明确不同组合光配比对提高植物抗病性的作用机制，推广绿色、生态、高效等不同光机制组合的病害防治技术，将会成未来研究的重要内容。