聚酮合酶基因岛在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行研究

陈艳淑, 罗陈烁, 杨滨

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是临床常见的革兰氏阴性致病菌,易引起严重感染[1]。当前高毒力和高耐药性的肺炎克雷伯菌均在世界范围内流行。不同于普通肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae,cKP),高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae,hvKP)更易导致社区获得性感染,引起肝脓肿、肺炎、脑膜炎等疾病[2-4]。近年来,以耐碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)为主的高耐药性菌株比例也逐年上升[5],这些变化给临床治疗带来极大的挑战。而聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因岛是编码肠杆菌目毒素因子的重要基因,并与细菌的其他毒力因子存在联系性[6]。PKS基因岛编码合成的基因毒素能够诱导真核细胞 DNA 损伤断裂[7]。研究[8]发现,感染PKS+肺炎克雷伯菌加剧患者淋巴细胞减少,并显著增加患者的死亡率[9],同时在小鼠脑膜炎的发展过程中发挥毒性作用[10]。因此,PKS基因岛与感染患者的病情进展存在关联。目前关于PKS基因岛在肺炎克雷伯菌中的研究主要集中在血流感染方面,对于PKS基因岛临床分布情况的分析相对较少。本研究收集临床分离的肺炎克雷伯菌株,分析PKS基因岛的临床分布特征,探讨PKS基因岛对患者感染情况的影响,为临床肺炎克雷伯菌感染的诊疗提供有效的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集福建医科大学附属第一医院(笔者医院)2019—2021 年病原菌感染患者送检的 234 株非重复肺炎克雷伯菌作为实验菌株。根据基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)鉴定结果判定为肺炎克雷伯菌,将其保存至细菌库。查询并记录感染者的临床资料。本研究获得笔者医院伦理委员会批准(伦理号:MTCA,ECFAH of FMU 〔2015〕 084-2)。

1.2 试剂与仪器 PCR 引物(福州尚亚生物技术有限公司);2×Taq PCR Master Mix(福州艾科瑞生物技术有限公司);4S GelRed 核酸染料[生工生物工程(上海)股份有限公司];DL2000 DNA Marker(福州艾科瑞生物技术有限公司);全自动快速生物质谱检测系统(美国布鲁克公司);全自动凝胶图像系统(Tanon-1600R,上海天能科技有限公司);PCR 扩增仪[VeritiTM DX96well thermal,赛默飞世尔科技(中国)有限公司];数显式稳压稳流电泳仪(EPS-300,上海天能科技有限公司);全自动细菌鉴定与药敏分析系统(Vitek-2 compact system,美国梅里埃公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌落筛选、鉴定与保存 挑取临床标本中的疑似肺炎克雷伯菌单菌落,通过MALDI-TOF MS 进行鉴定(分析范围 0～15 000m/z),根据飞行质谱标志峰的特点,将飞行质谱鉴定分值>2.0 的菌株判定为肺炎克雷伯菌进行后续实验。再采用分区划线法涂布于培养基,置于 37 ℃ 恒温箱过夜。将纯菌落保存在冻存管中,盖上盖子密封,并注明患者的姓名、细菌名称和保存日期后保存于-80 ℃ 冰箱。

1.3.2PKS基因检测 热裂解法提取 DNA,采用 PCR 筛查所有菌株的PKS基因。根据PKS基因的相关研究[11],其 4 个区域(clbA、clbB、clbN和clbQ)检测阳性认为PKS基因存在,引物序列参考文献 [12],具体信息见表 1。PCR 扩增条件:94 ℃ 预变性 5 min→95 ℃ 变性 30 s→53 ℃ 退火 30 s→72 ℃ 延伸 1 min,进行 30 个循环,最后 72 ℃ 延伸 10 min。扩增后的 PCR 产物加入 2% 琼脂糖凝胶板。电泳参数:100 mA,180 V,40 min。电泳后进行凝胶成像检测。将阳性扩增产物测序并比对分析。

1.3.3 资料收集 追踪 234 例肺炎克雷伯菌感染患者的病例资料,根据有、无PKS基因岛分为PKS+组和PKS-组。记录患者的病史,包括患者的基本资料(性别、年龄和科室)、实验室检查数据、感染部位和出院诊断等。

1.3.4 MALDI-TOF MS 筛选与药敏实验 采用 MALDI-TOF MS 鉴定PKS+菌株和PKS-菌株标志峰是否存在差别,使用全自动细菌鉴定与药敏分析系统进行临床常见抗菌药物的药敏试验。药敏结果根据 2019 年美国临床实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI)标准判定。

1.4 统计学分析 采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析。分类变量采用χ2检验进行分析。连续变量呈非正态分布,采用 Mann-WhitneyU非参数检验分析差别。P<0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR 验证 根据PKS基因的相关研究[11],PKS基因 4 个区域(clbA、clbB、clbN和clbQ)检测阳性为PKS基因阳性(图 1)。

PKS:聚酮合酶。M:GLred DNA Marker。A:PKS基因岛琼脂糖凝胶电泳结果;B:PCR扩增产物的部分测序结果;C:部分菌株PKS 基因岛琼脂糖凝胶电泳结果。

2.2 MALDI-TOF MS 鉴定结果 采用现有 MALDI-TOF MS 方法分析PKS+菌株和PKS-菌株的质谱特征峰,并叠加两者的飞行质谱结果(分析范围为 0～15 000m/z),可见二者的主要标志峰近似(图 2)。比较PKS基因表达的质谱图特征峰,二者并无差别。

PKS:聚酮合酶。MALDI-TOF MS:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。

2.3 菌株来源样本类型分布 本研究按照 MALDI-TOF MS 判定标准共纳入菌株 234 株。菌株来源样本类型包括痰液、血液、尿液、脓液、腹水和胆汁等 15 类,主要来源于痰液(70.1%,164/234)、血液(7.3%,17/234)、腹水/胆汁(5.6%,13/234)和脓液(4.3%,10/234)。

2.4PKS基因岛临床特征分布情况PKS+组与PKS-组感染者的性别、年龄构成上比较,差别无统计学意义(P>0.05)。PKS+组感染者中,来源于肝病中心(18.2%,16/88)较PKS-组感染者(6.2%,9/146)多(P=0.004),患有肝脓肿的比例(13.6%,12/88)较PKS-组感染者(1.4%,2/146)高(P<0.001)。其余结果见表 2。

表2 PKS 基因岛临床特征分布表

2.5PKS+肺炎克雷伯菌耐药情况 抗菌药物敏感性试验结果可见,PKS+菌株的耐药性较PKS-菌株低。PKS+菌株在氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明的抗菌药物敏感性更高(P<0.001,表3)。

表3 PKS 基因岛耐药情况表

3 讨 论

PKS基因岛为 54 kb 基因组成,主要编码合成PKS和非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)。该基因岛是肠杆菌目的重要基因,与多种细菌毒力因子相关[6]。含有PKS基因岛的菌株可以合成一种基因毒素——Colibactin。Colibactin 通过诱导真核细胞 DNA 双链断裂,染色体畸变,并使细胞周期停滞在 G2/M 期,以此发挥其毒性作用,并在细菌感染中具有重要价值[13-14]。携带有PKS基因岛菌株更易在新生儿尚未完全成熟的肠道中定植,随后通过血流转移至其他部位[15]。此外,PKS+肺炎克雷伯菌株感染小鼠后,对其大脑具有趋向性,在小鼠脑膜炎进展过程中发挥毒性作用[10]。目前关于PKS基因岛的研究主要在血流感染方面,对于肺炎克雷伯菌中对于PKS基因岛的研究还尚有不足。

在既往研究[11,13,16-17]中,肺炎克雷伯菌的PKS基因岛携带率为 3.5%～26.8%。本研究发现,PKS+菌株占临床分离株的 37.6%(88/234)。本研究结果较文献报道[11,13,16-17]的PKS+肺炎克雷伯菌的流行率更高,提示近年来的PKS基因岛在肺炎克雷伯菌表达具有流行趋势。考虑到PKS基因岛的细胞毒性作用,这种变化趋势应当引起高度重视,预防高毒力菌株在临床流行。

本研究发现,感染PKS+肺炎克雷伯菌的患者更易发生肝脓肿(P<0.001),而患者肝脏感染 hvKP 后更易形成脓肿并引起各种并发症[18-19],这意味着PKS基因岛在 hvKP 感染者肝脓肿形成中发挥重要作用。统计分析抗菌药物的敏感性发现,PKS+肺炎克雷伯菌的耐药性低。结合 hvKP 的相关研究[20]可知,肺炎克雷伯菌高毒力的存在通常伴随着药物敏感性的降低,因此,上述结果可能是由于PKS+肺炎克雷伯菌存在高毒力情况,但需要后续实验证实。同时笔者发现,高毒力菌株对于药物也出现耐药性,这提示菌株可能也存在耐药基因。肺炎克雷伯菌中毒力和耐药性的结合将是临床抗感染治疗的一个更大挑战。此外,对 MALDI-TOF MS 鉴定结果分析发现,不存在特殊的质谱标志峰快速鉴定PKS+肺炎克雷伯菌,这说明现有的微生物鉴定方式尚无法对PKS+肺炎克雷伯菌进行精准鉴定。因此,亟需探讨PKS基因岛的快速鉴定,进而针对肺炎克雷伯菌患者进行精准有效的治疗。

综上所述,PKS基因岛在肺炎克雷伯菌菌株的检出率具有日益增长的趋势,且更易导致肝脓肿的发生。PKS+肺炎克雷伯菌携带更多的毒力基因,并表现出相对较低的抗菌药物敏感性。应对PKS基因岛在肺炎克雷伯菌的流行情况引起高度重视,建议开展更广泛的监测,为临床治疗和预防其传播提供实验室依据。