桃叶珊瑚苷通过活化miR-1294/YWHAZ信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移

尹 恒 罗全慧 殷 浩 刘毅力 赵 琳

宫颈癌起源于宫颈上皮,是女性最常见的泌尿生殖道恶性肿瘤之一[1]。宫颈癌发病机制尚不明确,与乳头瘤病毒感染、吸烟、炎症等关系密切[2, 3]。早期宫颈癌患者的临床症状不明显,中晚期宫颈癌患者的治疗效果较差,预后不良[4, 5]。细胞增殖和迁移在宫颈癌的发生和进展中发挥重要作用[6～8]。桃叶珊瑚苷提取自车前草、玄参、地黄等传统中药材,是一种环烯醚萜苷化合物[9]。桃叶珊瑚苷在细胞氧化、增殖、凋亡、转移等过程中发挥调节作用,具有抗炎、抗肿瘤的功效[10]。桃叶珊瑚苷对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响尚未明确。本研究旨在探讨桃叶珊瑚苷对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响,结合双荧光素酶报告基因实验探究桃叶珊瑚苷可能的作用机制。

材料与方法

1.细胞、药品和试剂:宫颈癌C-33A细胞系购自中国科学院细胞库(上海)。桃叶珊瑚苷购自美国MedChemExpress公司(分析纯、批号:N20151634)。DMEM培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒、荧光素酶报告野生型载体WT-酪氨酸3单加氧酶-色氨酸5单加氧酶激活蛋白ζ(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta,YWHAZ)和突变型载体MUT-YWHAZ购自美国Promega公司。miR-1294序列、无意序列(miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司。二代测序由广州锐博生物科技有限公司完成。噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)试剂盒购自南京博恩生物技术有限公司。qRT-PCR试剂盒购自美国Thermo公司。一抗β-actin、YWHAZ、p-Akt、p-PRAS40、mTORC1、SGK1抗体均购自英国Abcam公司。

2.细胞培养和处理:宫颈癌C-33A细胞培养在含有10% 胎牛血清的DMEM培养基,培养参数为37℃、5%浓度CO2。C-33A细胞生长至对数期,分别采用0、20、40、60、80、100μmol/L桃叶珊瑚苷处理。经0μmol/L桃叶珊瑚苷处理的C-33A细胞为对照组,经80μmol/L桃叶珊瑚苷处理的C-33A细胞为桃叶珊瑚苷组,48h后收集各组细胞进行二代测序检测miRNA表达差异。

3.MTT法检测C-33A细胞增殖活性:将不同浓度桃叶珊瑚苷处理的C-33A细胞按照2.5×104个/毫升接种于96孔细胞板,每孔200μl,培养36h,在每个孔中加入10%质量浓度的MTT试剂15μl,培养箱中反应5h。真空吸去上清液,每孔添加130μl二甲基亚砜试剂,震荡30min,采用全自动酶标仪检测每孔C-33A细胞在490nm波长处的吸光度(A)值。

4.细胞划痕实验检测C-33A细胞迁移情况:将对照组和桃叶珊瑚苷组C-33A细胞悬液按照2.5×105个/毫升接种于24 孔板,每孔3ml。细胞贴壁后,经10μl移液器吸头在孔底直线划痕,10倍光学显微镜观察并分析划痕宽度C1。在培养箱内孵育24h,继续用光学显微镜观察并分析划痕宽度C2。对照组和桃叶珊瑚苷组C-33A细胞划痕愈合率(%)=(C1-C2)/C1×100%。

5.qRT-PCR检测miR-1294和YWHAZ mRNA表达:Trizol法提取C-33A细胞总RNA,琼脂糖凝胶分析RNA的纯度和浓度。采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。qRT-PCR扩增程序设置为97℃预变性10min,97℃ l5s,60℃退火40s,70℃延伸40s,41次循环。引物如下:miR-1294上游引物:5′- CTCACGAGAGAGGAAGGCA-3′,下游引物:5′-ACCTCAAGAACAGTATTTCCAGG-3′;β-actin上游引物:5′- CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′,下游引物:5′- AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′;YWHAZ上游引物:5′-CCTGCATGAAGTCTGTAACTGAG-3′,下游引物:5′-GACCTACGGGCTCCTACAACA-3′;U6上游引物:5′- TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′,下游引物:5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。miR-1294表达变化以U6为内参,YWHAZ mRNA表达变化以β-actin为内参。

6.靶基因预测和鉴定:通过MicroRNAdb数据库预测miR-1294具有互补结合位点的基因是YWHAZ。分别将WT-YWHAZ、MUT-YWHAZ 与miR-1294、miR-NC共转染至C-33A细胞,培养箱孵育48h。裂解细胞,采用双荧光素酶报告基因试剂盒分别检测C-33A细胞的萤火虫荧光素酶活性以及海肾荧光素酶活性,相对荧光素酶活性为二者的比值。

7.Western blot法检测YWHAZ和Akt信号通路蛋白表达:细胞裂解液裂解C-33A细胞,13000r/min离心40min,取上清加入蛋白缓冲液。经15%十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和硝酸纤维素膜转膜后,通过30g/L的脱脂牛奶封闭,分别添加一抗YWHAZ(1∶4000稀释)、p-Akt(1∶1000稀释)、p-PRAS40(1∶1000稀释)、β-actin(1∶4000稀释)、mTORC1(1∶2000稀释)、SGK1(1∶2000稀释),4℃摇床孵育10h。TBST溶液洗膜,添加二抗山羊抗鼠,室温摇床孵育2.5h。加入ECL发光显影液,在Bio-Rad成像仪中曝光、显影。

结 果

1. 桃叶珊瑚苷对C-33A细胞增殖活性的影响:MTT结果显示,0、20、40、60、80、100μmol/L桃叶珊瑚苷处理后宫颈癌C-33A细胞A值分别为1.02±0.17、0.75±0.06、0.61±0.10、0.41±0.05、0.17±0.09、0.47±0.12,与0μmol/L比较,不同浓度的桃叶珊瑚苷处理后的C-33A细胞增殖活性明显降低(F=28.90,P<0.05,图1),选择对C-33A细胞增殖活性抑制作用最明显的80μmol/L桃叶珊瑚苷做后续实验。

图1 桃叶珊瑚苷对C-33A细胞增殖活性的影响与0μmol/L比较,*P<0.05,**P<0.01

2.桃叶珊瑚苷对C-33A细胞迁移能力的影响:细胞划痕实验结果显示,对照组和桃叶珊瑚苷组C-33A细胞的划痕愈合率分别为59.28%±9.93%和25.75%±9.29%,差异有统计学意义(t=4.93,P<0.01,图2),表明桃叶珊瑚苷可抑制C-33A细胞的迁移能力。

图2 桃叶珊瑚苷对C-33A细胞迁移能力的影响

3.桃叶珊瑚苷对C-33A细胞miR-1294表达的影响:二代测序结果显示,对照组和桃叶珊瑚苷组C-33A细胞中miR-1294的表达差异最明显(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,对照组和桃叶珊瑚苷组C-33A细胞中miR-1294的表达分别为1.01±0.62和10.14±2.02,差异有统计学意义(t=8.65,P<0.01)。

4.生物信息学预测miR-1294的靶基因:采用MicroRNAdb数据库预测miR-1294具有互补结合位点的基因是YWHAZ,YWHAZ mRNA野生型位点和突变型位点详见图3。

图3 miR-1294与YWHAZ mRNA的互补结合位点

5.双荧光素酶报告基因实验验证miR-1294靶向结合YWHAZ mRNA:双荧光素酶报告基因实验结果显示,WT-YWHAZ+miR-NC和WT-YWHAZ+miR-1294相对荧光素酶活性分别为0.99±0.16和0.20±0.08,差异有统计学意义(t=8.76,P<0.01);MUT-YWHAZ+miR-NC和MUT-YWHAZ+miR-1294相对荧光素酶活性分别为0.98±0.11和1.01±0.24,差异无统计学意义(t=0.17,P>0.05,图4)。

图4 双荧光素酶报告基因实验验证miR-1294与YWHAZ mRNA的结合与miR-NC比较,*P<0.01

6.桃叶珊瑚苷对YWHAZ mRNA表达的影响:qRT-PCR结果显示,对照组和桃叶珊瑚苷组C-33A细胞中YWHAZ mRNA表达分别为4.74±1.22和1.01±0.22,差异有统计学意义(t=6.00,P<0.01)。

7.桃叶珊瑚苷对YWHAZ和Akt信号通路蛋白表达的影响:Western blot法结果显示,桃叶珊瑚苷处理C-33A细胞后,YWHAZ蛋白表达明显下降,Akt信号通路蛋白p-Akt、p-PRAS40、mTORC1、SGK1表达明显下降(图5)。

图5 桃叶珊瑚苷对C-33A细胞YWHAZ蛋白和Akt信号通路蛋白表达的影响与对照组比较,*P<0.01

讨 论

传统中药提取物已成为抗肿瘤药物研发的重要途径之一,越来越多的中药及其活性成分被发现能够抑制宫颈癌的发生和发展[11～13]。Yao等[14]研究表明,黄豆苷对宫颈癌细胞能够产生毒性作用,具有对宫颈癌细胞黏附的抑制特性,同时能够通过调控宫颈癌细胞线粒体膜的通透性,诱导宫颈癌细胞的凋亡。Xue等[15]研究表明,不同浓度的柴胡舒肝散对宫颈癌HeLa细胞系均具有明显的抗肿瘤作用,抑制宫颈癌HeLa细胞的生长和转移。Lin等[16]研究表明,柚皮苷能够诱导宫颈癌C-33A、SiHa和HeLa细胞的凋亡,触发细胞周期停滞,发挥明显的抗增殖作用。桃叶珊瑚苷是多种中草药如杜仲等的关键活性成分,能够减少活性氧的形成,具有显著的抗癌、抗炎作用[17]。本研究结果显示,宫颈癌C-33A细胞给予桃叶珊瑚苷处理后,C-33A细胞的增殖活性和迁移能力显著下降,提示桃叶珊瑚苷能够抑制宫颈癌细胞的恶性生物学行为。

微小RNA(miRNA)是一种长度约为22个核苷酸的低分子RNA,不具有编码蛋白的潜力,在转录水平发挥表观遗传调节作用,对靶基因的表达产生显著的负调节作用,其表达改变是中药活性成分发挥抗癌的关键调节机制[18,19]。miR-1294在肝癌、非小细胞肺癌、肾透明细胞癌等恶性肿瘤中低表达,恢复miR-1294表达能够显著抑制恶性肿瘤的进展[20,21]。Chen等[22]研究显示,miR-1294在宫颈癌组织和细胞系表达明显降低,过表达miR-1294可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解。本研究显示,宫颈癌C-33A细胞给予桃叶珊瑚苷处理后,miR-1294表达明显增加,提示桃叶珊瑚苷通过调控miR-1294表达发挥抗癌作用。

本研究进一步通过MicroRNAdb数据库预测miR-1294与YWHAZ具有互补结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1294能显著降低野生型载体WT-YWHAZ的相对荧光素酶活性,而对突变型载体MUT-YWHAZ的相对荧光素酶活性没有明显作用,证实YWHAZ能够靶向结合miR-1294。YWHAZ在哺乳动物细胞中是一种高度保守的基因,其编码的蛋白通过结合含磷酸丝氨酸的蛋白,参与调控多种分子信号通路的活化和抑制。研究显示,YWHAZ基因在宫颈癌组织中高表达,是一种癌基因,其可显著促进宫颈癌的发生和发展[22]。

本研究结果显示,宫颈癌C-33A细胞给予桃叶珊瑚苷处理后,C-33A细胞中YWHAZ基因表达显著减少,进一步证明YWHAZ是miR-1294的靶基因。YWHAZ蛋白主要通过激活Akt信号通路发挥促癌作用,而Akt信号通路在促进宫颈癌细胞增殖和迁移方面发挥关键作用[23～25]。本研究结果显示,桃叶珊瑚苷处理C-33A细胞后,Akt信号通路蛋白Akt信号通路蛋白p-Akt、p-PRAS40、mTORC1、SGK1表达明显下降,间接证明桃叶珊瑚苷在宫颈癌细胞中通过调节miR-1294/YWHAZ表达发挥抑癌作用。

综上所述,本研究探究了桃叶珊瑚苷通过活化miR-1294,抑制YWHAZ基因表达和Akt信号通路转导,进而降低宫颈癌C-33A细胞的增殖和迁移能力。本研究丰富了桃叶珊瑚苷的抗癌作用机制,为其临床应用提供了一定的实验基础。