超氧化物歧化酶在糖尿病视网膜病变中的研究进展

冉启艳,谭 薇

0 引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病并发症中最常见的微血管疾病,是导致工作年龄人群视力损害和失明的主要原因[1]。随着全球肥胖症患病率逐年增加和糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者的老龄化,目前DM严重影响全球健康问题。DM患病率在全球范围内呈上升趋势,根据最新国际糖尿病联合会估计,2030年将有5.78亿成年人患有DM,2045年将有7亿成年人患有DM[2],预计至2045年约有1.6亿人会受到DR的影响[3]。DR早期通常无症状,随着病情的进展,视力进一步下降,严重者出现糖尿病性黄斑水肿、玻璃体积血以及牵拉性视网膜脱离等,进而导致严重的视觉损害[4]。DR患者早期治疗主要依赖血糖水平的控制,血管病变严重者则需要行视网膜激光光凝术、玻璃体切除术。长期高血糖是引起DR的主要病理生理变化,高血糖加剧氧化应激反应,释放大量的活性氧自由基,导致视网膜毛细血管基底膜增厚,视网膜血管通透性增加,促进新生血管形成[5]。氧化应激是由自由基的形成和清除之间的不平衡引起。在生理条件下,ROS的主要功能是介导各种生物反应作为信号分子,然而,在病理条件下,ROS过度积累增加氧化应激反应促进视网膜氧化损伤[6]。氧化应激被认为是DR发生发展的重要因素之一[7]。因此,寻找新的治疗方式来延缓DR的发生发展非常有意义。目前抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及过氧化氢酶可以减轻活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的产生,这些抗氧化酶可以保护细胞免受其细胞毒性作用的影响[8],在视网膜中SOD活性的增加可以有效延缓DR的进展[9]。目前DR的发病作用机制尚不明确,本文就抗氧化物酶SOD在DR疾病中对周细胞、神经节细胞的保护作用研究进展进行综述。

1 SOD的家族

SOD是抗氧化酶库中的第一道防线,主要是通过中和超氧阴离子。SOD包括三种异构体,在哺乳动物中存在着三种SOD的同工酶,它们包括在胞质中依赖铜锌的形式(Cu/ZnSOD, SOD1)和线粒体依赖锰的形式(MnSOD, SOD2)以及在细胞外依赖铜锌的形式(extracellular-SOD, EC-SOD, SOD3)[10]。值得注意的是,每个亚型都需要一个氧化还原过渡金属在其活性位点来使O2-发生歧化。SOD1需要铜和锌作为辅助因子,存在于细胞质、细胞核、以及过氧化物酶和线粒体内膜中[11]。EC-SOD的异构体是另一种含铜和锌作为辅助因子来维持氧化还原活性,EC-SOD的异构体由平滑肌细胞产生并释放。有研究表明EC-SOD在DR和心血管疾病中发挥重要作用。线粒体SOD需要锰作为辅助因子,SOD2主要是线粒体超氧化物清除剂,被认为是有氧生存所必需的条件[12]。

2 SOD与DR的关系

DR是DM主要微血管并发症之一,体内持续高糖水平是诱导视网膜病变的重要原因之一[13],高血糖引发炎症反应的同时,加剧氧化应激反应,释放大量的ROS。高血糖引起的细胞损伤、氧化应激和ROS是介导DM并发症发生发展的关键因素[14]。ROS与抗氧化防御系统之间的平衡被打破,破坏细胞膜的完整性并刺激细胞发生氧化反应,进而加重视网膜氧化损伤,最终导致视网膜微血管损伤以及血-视网膜屏障的破坏[15]。SOD在人类健康和疾病中发挥着重要作用[16],其活性增加是DR中最重要的抗氧化防御系统之一。目前研究证据表明,DR发病机制极为复杂,是一种由多因素共同作用导致的疾病,其中氧化应激在DR的发生发展过程起着重要作用。在高糖环境下,随着多元醇途径及己糖胺途径的激活、血管紧张素Ⅱ及晚期糖基化终产物的生成增加以及二酰甘油-蛋白激酶C系统的活化,增加氧化应激和ROS产生,以及活化的B细胞激活核因子导致炎症的进一步发生。ROS在视网膜中过量生成,引起氧化应激和线粒体的损伤,导致局部炎症和内皮细胞凋亡,从而使血管通透性增加、视网膜缺氧及新生血管的形成,最终导致DR的发生发展[17]。SOD是一种主要的抗氧化酶,主要通过加速SOD的突变反应来保护细胞免受超氧化物的损伤。SOD与过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶协同发挥作用,可以有效降低ROS的有害作用。研究表明,与健康人(正常对照组)相比DR组中血清SOD的活性值均降低,且在不同程度的DR组中患者体内SOD也有差异,严重非增殖性DR组SOD的活性水平明显低于前期DR组,随着DR的进展,血清中SOD的活性值呈逐渐下降的趋势[18]。ROS的过量生成降低了抗氧化酶的活性,从而导致细胞氧化损伤增加。重要的是,由于抗氧化酶调节失衡,细胞容易发生氧化损伤进一步促进DR进展[19]。SOD和过氧化氢酶是抗氧化酶中重要的两种酶,SOD是促进超氧化物转化为过氧化氢,随后被谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶分解为氧气和水[20],广泛存在于生物体内是生物体内清除氧自由基的重要物质,可以阻止氧自由基对细胞造成的损害。其中,过氧化氢酶也是一种常见酶,催化过氧化氢分解为水和氧气,过氧化氢酶的活性可以反映细胞清除ROS的能力和抗氧化损伤的能力。综上所述,机体通过诱导抗氧化基因的表达来清除氧自由基,产生细胞内源性保护作用,使氧化应激及抗氧化应激反应处于动态平衡状态,但是,在高血糖环境下,这种动态平衡被打破,从而促进视网膜内皮细胞的氧化损伤。因此,维持抗氧化酶SOD的水平在延缓DR的发生发展中有着重要作用。

3 EC-SOD在DR中对周细胞的保护作用

周细胞是构成正常微血管管壁的细胞,在体内血管新生时可以降低血管基质、控制内皮细胞增殖、调控新生血管生长的功能[21]。周细胞是由外胚层或中胚层发育而来的平滑肌样细胞,通过基底膜包裹毛细血管内皮细胞。Müller细胞是视网膜神经胶质细胞,与血管和神经元密切联系。这些类型的细胞包围着内皮细胞,使细胞-细胞相互作用维持视网膜功能。研究表明中枢神经系统、胸腺、视网膜和脉络膜中的周细胞由分化的神经嵴源细胞发展而来[22]。周细胞是包围着微血管毛细血管内皮、末梢小动脉和毛细血管后小静脉的平滑肌样细胞,具有收缩功能[23]。视网膜微血管中周细胞的缺失是DR最早被观察到的形态学改变,与内皮细胞的比例下降至1∶4[24]。周细胞穿透基底膜与内皮细胞接触,从而影响内皮细胞的生长和功能,这表明周细胞与内皮细胞之间或周细胞自身之间的细胞间联系可能在维持血管系统氧化还原稳态中发挥作用。

EC-SOD位于细胞外液中,它与硫酸乙酰肝素蛋白和胶原蛋白结合,将EC-SOD蛋白锚定在细胞外基质上[25]。EC-SOD抗氧化酶在ROS调节中起着核心作用,EC-SOD可以清除超氧化物自由基,研究表明,EC-SOD与Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白通过肝素结合,从而保护它们免受氧化损伤[26]。周细胞的损失被认为是早期DR的标志,周细胞在DR发病机制中的研究从开始以来就受到了广泛的关注,在视网膜微血管系统中,内皮细胞被周细胞和Müller细胞足突包围。一定的ROS在细胞中不断产生,以维持细胞内环境的稳定,然而,过度的内源性和外源性ROS的产生和ROS的去除不足导致氧化应激反应,可能通过VEGF和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-ɑ,TNF-α)[27]的表达增加微血管周细胞的脱落。据报道,抗氧化剂的使用可以防止糖尿病大鼠视网膜病变的发生。在动物模型中探索了EC-SOD的重要性在脂多糖诱导的小鼠角膜炎症模型中,缺乏EC-SOD的小鼠出现更严重的内皮细胞发生炎症变化[28],在EC-SOD基因转染小鼠可以抑制视神经脱髓鞘[29]减轻内皮细胞炎症变化。然而,视网膜血管细胞分泌的因素往往会损害自己,以自分泌的方式伴随着EC-SOD减少,从而刺激炎性因子的表达增加。研究结果表明对链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠用EC-SOD处理可改善氧化应激相关的视网膜氧化损伤,在EC-SOD治疗中有效改善了糖尿病大鼠的视网膜Müller细胞活化和周细胞功能障碍,并减弱了糖尿病大鼠a波和b波振幅的损失,EC-SOD还改善了视网膜穆勒细胞的活化和神经炎症[30]。周细胞中的EC-SOD表达降低和促炎因子的刺激可能诱发和促进视网膜微血管异常。EC-SOD不仅具有抗氧化特性,还具有抗血管生成、抗增殖、抗趋化和抗炎特性[31]。综上所述,EC-SOD在DR中对周细胞发挥了保护作用,改善周细胞的功能障碍,阻止了早期毛细血管变化和炎症的发生过程,进一步抑制视网膜早期氧化损伤。值得注意的是,目前未能明确指出EC-SOD对中晚期DR中的周细胞是否也有保护作用。因此,希望在未来治疗中EC-SOD有望成为DR的一个有吸引力的治疗靶点,通过维持高水平的EC-SOD可能会减轻视网膜氧化损伤延缓DR的进展,这有待临床中进一步研究。

4 SOD在DR缺血-再灌注损伤中的保护作用

视网膜缺血是引起视力损害的常见眼病的致病因素,包括青光眼、DR、视网膜中央动脉闭塞[32]。缺血可以诱导一系列有害事件,如线粒体功能障碍、释放兴奋性谷氨酸、细胞内钙离子的积累,其中,引起线粒体一系列氧化反应,并为各种细胞活动产生能量,维持膜电位和保存细胞内离子稳态。缺血、缺氧时线粒体发生的功能障碍在诱导神经变性中起者核心作用[33]。正常情况下,超氧化物通过SOD和谷胱甘肽过氧化物酶清除,在缺血状态下,氧化水平升高,抗氧化剂水平降低,从而诱导视网膜的氧化损伤。由于代谢的中断,抗氧化酶不能立即除大量的游离自由基,从而导致ROS过度积累。在体外实验中,高血糖条件下观察到超氧化物水平的增加伴有视网膜细胞中过氧化氢含量的增加,氧化应激是缺血性损伤的重要病理特征,常导致视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)丢失和血管功能障碍的后节段病变[34]。研究证实缺血-再灌注损伤产生过氧化氢、次氯酸盐、超氧自由基等产生多种ROS[35]。此外,缺血-再灌注损伤后SOD等抗氧化酶氧自由基清除率降低,进一步加重眼部组织氧化应激反应。因此,针对线粒体功能障碍的早期有效干预可以通过降低ROS的产生来恢复RGCs的功能[36-37]。抗氧化基因治疗被认为是与DR、缺血-再灌注损伤相关的青光眼、视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病变的一种治疗选择,通过基因载体将编码抗氧化酶的质粒导入RGCs,以抵抗RGCs的氧化损伤[38]。目前直接将SOD等抗氧化酶输送到RGCs是治疗DR疾病的一种替代策略。SOD是缺血损伤和修复的主要决定因素,直接将SOD蛋白送入RGCs的非病毒载体中,以降低视网膜缺血时ROS活性。一种富含硼酸的树突状分子(boronic acid-rich dendrimer, BARD)已作为非病毒基因和蛋白质载体而得到广泛关注,它在细胞内传递天然蛋白和多肽时具有强大的功效,并保持其生物活性[39],BARD是一种被广泛应用于药物和基因载体的纳米聚合物。树突状大分子具有高密度的官能团,能够调控局部环境,实现独特的组织相互作用,这些都有利于新疗法的发展[40]。BARD能够通过氮硼配位和离子相互作用[41]与各种蛋白共同组装成纳米颗粒,而SOD是一种保护酶,可以清除超氧自由基及其代谢产物,因此使用BARD将SOD传递到眼细胞中达到下调氧化应激。在视网膜缺血模型中,通过BARD介导的SOD纳米制剂能有效保护视网膜功能,减少RGCs的凋亡[42]。

另外研究表明在缺血-再灌注诱导的大鼠视网膜损伤每日通过肢体远端缺血条件反射(limb remote ischemic conditioning, LRIC)来增加抗氧化防御[43]来减轻缺血-再灌注诱导的大鼠视网膜损伤。缺血条件反射被认为是一种通过内源性保护机制来启动的对多种器官缺血性损伤的保护形式[44]。有报道称,在1型和2型糖尿病动物模型中,眼压升高引起的视网膜缺血条件反射可预防和减轻视网膜功能损害[45]。研究者在动物实验和临床研究中都证明了LRIC也具有神经保护作用。Brandli[46]报道LRIC通过显著增加光致视网膜损伤动物模型的a和b波振幅,也具有保护作用。研究LRIC对DR的处理对抗氧化酶的影响,在大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉,缺血10min和再灌注10min,在STZ注射4d后应用LRIC治疗,此后每天重复,持续12wk后,通过对血浆SOD/过氧化氢酶比值和还原性谷胱甘肽(glutathione, GSH)/氧化性谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)比值的测定,与正常Sprague-Dawley大鼠对照组相比,DM组大鼠视网膜中SOD和谷胱甘肽活性分别显著降低16.8%,与DM组相比,LRIC治疗组大鼠视网膜中SOD活性显著提高19.1%,结果表明LRIC可增强SOD和GSH活性[47]。

综上所述,在缺血、缺氧中通过BARD将SOD蛋白送入RGCs的非病毒载体中将是抗氧化基因治疗DR的一个靶点来减少或预防视网膜并发症,减少氧化和炎症效应对DR是非常有益。也可通过LRIC治疗提高SOD的活性对DR保护发挥了重要的作用。因此,希望在未来治疗方案中有待考虑。

5 总结与展望

综上所述,目前DR的发病机制尚不明确,以往对DR的病因研究及治疗多集中于关注视网膜毛细血管病变,研究发现在DR早期能够提高SOD活性延缓DR的发生发展。抗氧化酶可以抑制ROS的生成、清除自由基、增强抗氧化防御系统的功能延缓DR很重要。因此,希望未来在SOD维持DR氧化还原反应动态平衡的作用和机制中展开进一步研究,为临床治疗DR提供依据支持。