基于网络药理学及实验验证探讨枸杞子治疗干眼的作用机制

穆玉雪,胡名状,危冬昱,许馨月,姚李凌萱,张作明,陈 涛,4

0 引言

干眼(dry eye,DE)已成为眼科疾病当中除屈光不正以外最常见的疾病,有文献报道,国外DE的发病率为5.5%～33.7%,而我国DE的发病率为21.0%～30.0%,发病率较高[1-2]。近年来,我国军人DE的发病率也渐增加,成为我军非战斗减员因素之一[3]。DE主要是由于泪液功能障碍而导致的角膜屏障破坏的一类眼科疾病,主要表现为眼部的刺痛、干涩、畏光、异物感等眼表损害、视觉功能紊乱现象,并且常有眼疲劳的症状出现,严重者可导致失明,治愈后易复发。在流行病学上,全世界约有5%～30%的人会受到DE的影响[4]。目前西医在治疗DE方面多以缓解症状、改善体征为主,且临床在治疗DE方面常用的药物主要以促进泪液分泌、泪液成分的替代治疗及抗炎与免疫抑制药物进行治疗,对于症状较重的患者,会考虑给予手术治疗,研究发现促进泪液分泌类的药物及人工泪液的作用机制尚不明确,且局部使用类固醇类药物可能引起眼压升高和晶状体囊下混浊的副作用[5]。DE在中医上属于“神水将枯”的范畴,主要基于“肝开窍于目,泪乃肝之液”的理论,若是肝血亏虚,津液分泌不足,则两目干涩[6]。枸杞子属茄科植物,来源于其果实,枸杞子味甘、性平,归肝肾经,具有明目,滋补肝肾的功效,因此在治疗由肝肾亏虚所致的眼部疾病方面具有较好的疗效[7]。药理学研究表明枸杞子具有抗氧化、抗衰老的功效,及在阿尔茨海默症的治疗方面具有较好的疗效[8],除此之外,研究发现枸杞子提取物在防治视网膜疾病,及抗视疲劳等方面具有较好的疗效[9]。因此采用网络药理学的方法来探讨枸杞子治疗DE的活性成分及作用靶点,分析枸杞子治疗DE的作用机制,从而为枸杞子在临床治疗DE方面提供科学依据,具有重要的意义。

1 网络药理学研究和动物实验

1.1 网络药理学研究

1.1.1 枸杞子的活性成分及相应靶点通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)搜索中药“枸杞子”,并设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness, DL)≥0.18作为筛选条件,搜索枸杞子相关的药物活性成分及靶点等。

1.1.2 枸杞子靶点基因的预测及DE靶点基因的筛选借助于Uniprot数据库(http://www.Uniprot.org/)将TCMSP数据库中筛选得到的枸杞子关键化学成分信息转换成相应的靶点,然后借助于GeneCards数据库(https://www.Genecards.org/)和OMIM数据库(https://www.omim.org/)搜索“Dry eye(DE)”相关基因,并导出“DE”相关基因。

1.1.3 枸杞子和DE靶点交集的筛选为了获得“枸杞子”与“DE”共同靶点基因,借助于“R”语言程序软件进行筛选,并以韦恩图的形式展示。

1.1.4 枸杞子活性成分-靶点基因-DE网络调控构建通过借助于perl程序软件,获得DE与枸杞子共同作用靶点,然后通过Cytoscape 3.7.2软件来绘制枸杞子活性成分-靶点基因-DE可视化网络图。

1.1.5 蛋白与蛋白相互作用网络构建通过将枸杞子和DE共同靶点输入到String数据库(https://stringdb.org/),物种选择“Homo sapiens”,得到蛋白与蛋白相互作用(PPI)网络图,并且为了更准确地获得数据分析结果,通过高级设置筛选得分≥0.4来隐藏网络图中游离的蛋白质,其余参数均设置为默认,最后导出枸杞子和DE相互作用网络图,将String数据库导出的结果转换制作成PPI条形图。

1.1.6GO功能与KEGG通路的富集分析通过Bioconductor(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)数据库,借助于R软件(colorspace、stringi、DOSE、clusterprofiler、pathviwew)安装包获得枸杞子治疗DE的关键靶点,用R软件安装包进行GO(gene ontology)功能富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)生物功能富集,并设定P<0.05,Q<0.05,最终输出结果以R语言作图来展示。

1.2 动物实验

1.2.1 材料和主要试剂蛋白激酶(AKT1)多克隆抗体、白细胞介素-6(IL-6)多克隆抗体、白细胞介素-17(IL-17)多克隆抗体、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及GAPDH多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司),荧光素钠购自美国Sigma公司(批号46960-100G-F)、泪液检查酚红棉线购自天津晶明新技术开发有限公司(批号20211201)。

1.2.2 动物分组和造模雄性C57小鼠(20±2g,8周龄),由空军军医大学实验动物中心提供。实验动物的饲养和使用符合视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范(许可证号:SYXK-BIT-20200107001),小鼠领回后先在动物室内饲养1wk(12h明暗循环,自由饮水和进食),动物房内温度控制在(23±1)℃,相对湿度约50%。1wk后随机分为对照组和实验组。对照组不做任何处理,实验组小鼠每天给予2%苯扎氯胺溶液滴眼,每天2次,每次5μL,两次造模时间间隔8～10h,连续给药1～4wk,每组6只。

1.2.3 泪液分泌测定及角膜上皮荧光素钠染色泪液分泌测定:分别在造模1、2、3、4wk时检测小鼠泪液分泌量,小鼠腹腔注射10g/L戊巴比妥钠,使其麻醉固定,用眼科显微镊夹持酚红棉线,将其置于小鼠下结膜囊中外1/3处,停留60s取出,用游标卡尺测量棉线湿润长度,检测泪液分泌量。角膜上皮荧光素钠染色:将荧光素钠溶液滴至小鼠右眼结膜囊内进行角膜荧光素染色,用裂隙灯显微镜在钴蓝光下观察角膜变化,角膜损伤部位可见嫩绿色着色,即为角膜上皮荧光素钠染色。

1.2.4 蛋白免疫印迹检测结膜组织中AKT1、IL-6、TNF-α及IL-17蛋白表达分别在造模时间点结束时,给小鼠腹腔注射10g/L戊巴比妥钠进行麻醉,处死小鼠,取小鼠结膜组织,蛋白提取,BCA法测定蛋白浓度,每管上清液中分别加入50μL 5× Loading Buffer,100℃煮沸15min,使蛋白变性。按照SDS-PAGE凝胶电泳说明书进行电泳,PVDF转膜90min。在封闭液中室温静置2h,加入稀释好的一抗AKT1(1∶1000)、IL-6(1∶1000)、TNF-α(1∶800)及IL-17(1∶1000)4℃孵育过夜,Tween-PBS洗3遍一抗,每次10min,加入二抗,在室温条件下摇动1～2h,Tween-PBS洗3遍二抗,每次10min,显色。使用Quantity one软件进行分析,测定各条带的平均光密度值(OD值),将待测蛋白质表达量与内参照GAPDH表达量进行对比,用以表示蛋白质的相对表达水平。

统计学分析:采用SPSS22.0统计学软件进行数据处理,实验数据以均数±标准差表示,组间比较采用独立样本t检验,组内不同时间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 枸杞子的活性成分及对应靶点通过TCMSP数据库获得枸杞子有效化学成分188个,设置OB≥30%及DL≥0.18筛选获得45种有效活性成分,主要包括,甾醇类:如Sitosterol alpha1(谷甾醇α1)、Cycloartenol(环戊烯醇)、LAN[4,4,14α-三甲基-5α-胆甾醇-9(11),24-二亚乙基三胺-3β-醇]、Stigmasterol(豆甾醇)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、24-ethylcholest-22-enol(24-乙基胆甾-22-烯醇)、campesterol(菜油甾醇)、24-ethylcholesta-5,22-dienol(24-乙基胆甾5,22-二烯醇)、24-methyl-31-norlanost-9(11)-enol(24-乙基胆甾5,22-二烯醇)、24-methylenelanost-8-enol(24-亚甲基-8-烯醇)、31-Norcyclolaudenol(31-去甲甾醇)、31-norlanost-9(11)-enol(31-去甲甾醇)、31-norlanosterol(31-去甲甾醇)、6-Fluoroindole-7-Dehydrocholesterol(6-氟吲哚-7-脱氢胆固醇Obtusifoliol钝叶醇)等;多糖类:如Physcion-8-O-beta-D-gentiobioside(大黄素-8-β-D-龙胆二糖苷)、7-O-Methylluteolin-6-C-beta-glucoside_qt(7-O-甲基木犀草素-6-C-β-葡萄糖苷)等;生物碱类:如atropine(消旋莨菪碱)等,见表1,将枸杞子45个活性成分与Uniport数据库进行基因校对,删除重复,剩余对应靶点有174个,见图1。

表1 枸杞子活性成分

图1 枸杞子成分靶点作用于DE靶点的韦恩图。

2.2 枸杞子与DE的共同靶点通过Genecards和OMIM数据库搜索DE的基因靶点,并且设置相关性评分大于5,最终得到DE的靶点基因共4080个,将枸杞子与DE靶点基因通过采用R软件安装包进行基因映射,得到枸杞子与DE的共同靶点131个(图1)。

2.3 药物活性成分-作用靶点-相关疾病网络构建利用Cytoscape3.7.2软件将枸杞子化学成分及交集靶点构建化合物-靶点相互作用网络图,发现共有节点154个,枸杞子治疗DE的活性成分27个,协同作用于DE的靶点有131个,节点与节点之间的作用关系,即边(edge)570条(图2)。

图2 枸杞子治疗DE的“药物-成分-疾病-靶点”网络图。

2.4PPI网络构建为了更进一步地分析枸杞子治疗DE的作用机制,在String数据库中输入48个共同靶点基因,研究物种选择为“Homo sapiens”,将筛选得分设置为≥0.4,通过隐藏游离的节点,得到PPI网络图,见图3。图中节点有120个,边有2119条,通过PPI网络图我们可以看出枸杞子对DE的治疗是通过多途径多靶点的方式。利用R软件对String数据库中获取关联数据进行排序,得到连线数最多的30个关键节点,即核心靶点,绘制成图。推测这些靶点可能是枸杞子治疗DE的关键靶点,从图中可以看出与AKT1连线的有95条,与IL-6连线的有87条,依次是VEGFA、CASP3、JUN、PTGS2、CXCL8、IL1B等,由此可以说明这些是最为关键的核心靶点并且各靶点之间存在较密切的关系,见图4。

图3 DE-枸杞子PPI蛋白相互作用网络靶点图。

图4 枸杞子治疗DE的核心靶点图。

2.5GO功能富集分析与KEGG富集分析

2.5.1GO功能富集分析用R软件colorspace、stringi、DOSE、clusterprofiler、pathviwew安装包对枸杞子-DE的131个共同靶点进行GO生物富集分析,其中所涉及166种生物学功能与过程,根据富集p值最小的前20位包括了核受体活性、配体激活的转录因子活性、DNA结合转录因子结合、G蛋白偶联胺受体活性、细胞因子受体结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、转录共激活因子结合、细胞因子活性、转录辅因子结合等,见图5,展示了前20位GO分析结果。

图5 前20位GO功能富集分析生物学过程。

2.5.2KEGG富集分析对枸杞子治疗DE的131个关键靶点进行KEGG富集分析,根据P≤0.05的结果,共富集到154条信号通路,绘制排名前20位的KEGG气泡图,主要涉及TNF-α、IL-17及HIF-1等信号通路,见图6。

图6 前20位的KEGG气泡图。

2.6 动物实验

2.6.1 小鼠泪液分泌测定在造模1wk时两组小鼠泪液分泌量差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,模型组小鼠泪液分泌量在造模2、3、4wk泪液分泌量减少,差异有统计学意义(t=19.083、16.485、29.734,均P<0.05),见表2。

表2 两组小鼠不同时间泪液分泌量比较

2.6.2 角膜荧光素钠染色与对照组相比较,用苯扎氯胺溶液滴眼1wk后,模型组小鼠角膜上皮出现少量细点状荧光素钠着色;造模2wk后,模型组小鼠荧光素钠着色明显,少量片状;造模3wk后,模型组小鼠角膜上皮出现不同程度的点状、片状侵损;造模4wk后,模型组小鼠出现明显的角膜混浊(图7)。

图7 各组小鼠荧光素钠染色图像。

2.6.3 各组结膜组织中AKT1、IL-6、TNF-α及IL-17的蛋白表达水平基于网络药理学分析结果,我们选择AKT1、IL-6、TNF-α及IL-17作DE疾病蛋白表达标志物,以探究相关因子在DE疾病中的作用机制。与对照组相比,随着时间增加,模型组小鼠各相关蛋白的表达随着造模时间的延长AKT1、IL-6、TNF-α及IL-17表达量增加,其中AKT1、IL-6及TNF-α在造模1wk时蛋白表达量显著升高(均P<0.05);IL-17在造模2wk时蛋白表达量显著升高(P<0.01),见图8。

图8 各组小鼠结膜组织中AKT1、IL-6、TNF-α及IL-17蛋白表达比较 A:Western blot蛋白印记结果;B～E:各蛋白灰度值统计分析。aP<0.05,bP<0.01 vs 对照组。

3 讨论

DE发病机制较为复杂,受内、外影响因素较多。临床研究及实验研究发现,枸杞子在治疗眼底病方面具有较好的疗效,但是枸杞子及提取物治疗眼部疾病的机制尚不明确。本研究主要是通过采用网络药理学的方法,探讨枸杞子治疗DE的活性成分及其作用靶点。通过TCMSP数据库平台检索分析发现枸杞子主要的活性成分有45种,其中主要包括了自由度较高的槲皮素、β-谷甾醇、阿托品、谷甾醇α1等主要成分,表明这几种成分在治疗DE中起着重要的作用。其中槲皮素是自由度值最高的,现代药理学研究发现槲皮素在抗炎[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]、抗肿瘤[13]及心血管保护[14]等方面具有较好的药理作用。在治疗眼科疾病方面,研究发现槲皮素可对自身免疫性葡萄膜炎[15]及氧化导致的视网膜损伤[16]具有较好的治疗作用,并且有研究发现其可抑制脉络膜-视网膜新生血管的形成[17]、大鼠晶状体上皮细胞的凋亡及视网膜退行性变[18]等。β-谷甾醇具有显著的抗炎作用,研究发现β-谷甾醇主要是抑制了NF-κB/NLRP3炎症反应途径,从而抑制IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子介导的炎症反应[19-20]。

PPI分析发现,AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN、PTGS2、CXCL8等靶点是枸杞子治疗DE的核心靶点,通过采用GO生物学富集分析,上述核心靶点主要是通过影响核受体活性、配体激活的转录因子活性、DNA结合转录因子结合等对干眼进行调控的。AKT1作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种,在调控细胞的增殖、凋亡及血管生成方面起着重要作用[21]。研究发现其在增殖性玻璃体视网膜病变的形成中起重要作用。IL-6在损伤修复及炎症免疫反应中起着重要的调控作用,研究发现在DE患者中IL-6表达水平升高,参与DE的炎症反应。VEGFA作为VEGF的一种,在促进内皮细胞分裂增殖和细胞迁移方面起着重要的调控作用,除此外,该因子也可增加血管的通透性。在DE的发病机制当中,其中VEGF在调节内皮细胞反应当中起着重要的作用[22]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是应激诱导的丝裂原活化蛋白激酶家族的成员,研究发现其可参与视网膜细胞的凋亡调控及视网膜退行性变,并且可参与多种疾病的炎症反应,研究发现DE的发病与炎症因素密切相关,c-Jun可能参与DE疾病的发生发展[23]。半胱氨酸天冬氨酸激酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3,Caspase-3)的表达与活化在细胞凋亡的过程中起着最终的执行作用,导致细胞凋亡。研究发现,缺血再灌注的小鼠视网膜中、糖尿病大鼠及高眼压大鼠视网膜神经节细胞中,Caspase-3的表达含量升高[24]。PTGS2是环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的编码基因,可被促炎细胞因子、生长因子等诱导激活,从而参与炎性反应、细胞增殖、细胞凋亡等多种病理过程,研究发现IL-1β、IL-6等炎性细胞因子参与DE的炎症反应,可参与激活PTGS2介导DE疾病的发生发展[25]。CXCL8是重要的炎症介质,研究发现在DE患者泪液及血液中处于高表达,因此证实了DE是由炎症介导的发病机制,从而对DE的严重程度产生一定的影响[26]。

根据KEGG富集分析发现,枸杞子治疗DE涉及了多条信号通路,是通过多途径、多靶点进行治疗的,其中TNF-α、IL-17及HIF-1等信号通路显著性较高,可能是枸杞子治疗DE的关键信号通路。研究发现DE患者眼睑内面,如TNF-α等促炎因子含量是高表达的,且TNF-α表达越高,DE患者的泪液分泌就越少,患者的病情就越重[27-28]。IL-17是自身免疫疾病和许多炎性疾病的重要促炎因子,研究发现DE患者泪液中IL-17的浓度显著高于非DE患者,并且通过采用抗IL-17抗体可抑制Th17细胞,从而减轻DE的严重程度[29-30]。HIF-1为缺氧诱导因子,研究发现HIF-1α的激活可防止DE诱导的泪腺腺泡细胞死亡,从而对DE起着重要的调控作用,影响着泪腺细胞的增殖凋亡等生理过程[31]。

目前DE常用的动物模型为大鼠、小鼠及兔等,而有文献报道小鼠在DE模型中使用较为普遍[32],为此我们选择C57小鼠,采用苯扎氯铵药物进行造模,苯扎氯胺是制作DE常用的药物,大、小鼠均可以进行造模,连续给药14d就可以造模完成,并且模型持续时间不少于14d,其可以导致与人类DE临床表现及病理症状相类似的现象,主要表现为泪膜不稳定、眼表炎症、角膜上皮细胞凋亡与眼表损害等[33],并且通过实验我们发现在造模14d后,泪液分泌显著减少(P<0.05)。基于网络药理学分析结果,我们选择了在DE发病中起着重要调控的蛋白分子AKT1、IL-6、TNF-α及IL-17,作为DE疾病蛋白表达标志物,通过实验探究相关因子在DE疾病中的作用机制。通过实验验证发现,与对照组相比,随着造模时间的增加,模型组小鼠各相关蛋白的表达也随时间的延长表达量逐渐增加,从而可以明确基于网络药理学数据库所获得的相关靶点基因与DE疾病存在密切的联系,在调控DE疾病中起着重要的作用。

综上所述,本文通过网络药理学分析发现枸杞子的主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、阿托品、谷甾醇α等主要成分,涉及治疗DE的关键靶点主要包括AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN、PTGS2、CXCL8等,枸杞子治疗DE的关键途径为TNF-α、IL-17及HIF-1α等信号通路,枸杞子治疗DE的发病机制主要是通过调控炎症反应及细胞凋亡等相关的信号通路来达到抗炎及抑制细胞凋亡的,从而抑制DE的发生发展,起到治疗作用[34]。通过网络药理学分析充分说明枸杞子是通过多成分、多靶点、多途径治疗DE的,并且枸杞子的药理学数据分析表明枸杞子对DE的治疗存在一定的可行性,实验验证后确实与相关的靶点基因存在密切关系,可对后续的科研研究及临床新型药物的研发提供一定的理论、实验依据及研发思路。