新乡地区Rh阴性无偿献血者Rh表型分布及RhD变异型基因型分析

赵 甜，张晨光，庞桂芝

(1.新乡市中心医院检验科,河南 新乡 453000;2.新乡医学院公共卫生学院,河南 新乡 453003;3.新乡市中心血站血型室,河南 新乡 453001)

Rh血型是较复杂的人类红细胞血型系统,Rh血型系统包括55种抗原,其中D抗原的免疫原性最强。当个体红细胞上存在D抗原时,称为Rh阳性;当缺乏D抗原时称为Rh阴性,目前中国大部分人为Rh阳性。阴性个体若输注1个单位的Rh阳性红细胞,27%～56%个体可发生免疫反应,产生抗D抗体[1]。因此,需准确鉴定Rh血型,以便临床实施科学合理的输血治疗方案,避免严重溶血性输血反应、新生儿溶血病发生。RHD基因位于人1p34～1p36染色体,由10个外显子构成。D抗原位于RHD基因编码的D多肽链上,RHD基因的缺失、重组、突变等可引起D抗原表达异常,导致RhD变异型的产生[2]。由于临床常规血清学方法的局限性,很难正确鉴定RhD变异型,因此,本研究采用血型血清学试验和基因测序方法对新乡地区无偿献血者中RhD变异型个体进行基因型分析,了解RHD基因的多态性特点,为构建新乡地区RhD变异型数据库及临床精准输血治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年1月至2019年12月于新乡市中心血站无偿献血的110 667名无偿献血者为研究对象,其中男67 506例,女43 161例;年龄18～55(38.55±10.27)岁。本研究获新乡医学院伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂与仪器ABO血型定型红细胞试剂购自长春博德生物制品有限责任公司,抗-A、抗-B、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)M单克隆抗-D、IgM单克隆抗-E、IgM单克隆抗-e、IgM单克隆抗-C、IgM单克隆抗-c标准血清、抗人球蛋白试剂购自上海血液生物医药有限责任公司,IgG+IgM抗-D购自法国Diagast公司、美国Immucor公司,全血基因组DNA提取试剂盒、2×Taq Master Mix(Dye)购自北京康为世纪生物科技有限公司,100 bp DNA Ladder Marker购自北京赛默飞世尔科技有限公司,Agarose琼脂糖购自西班牙Biowest公司;血清学专用离心机来购自长春博研科学仪器有限责任公司,调速型迷你离心机购自上海生物工程公司,台式高速低温离心机购自德国 Sigma 公司,核酸蛋白测定仪、梯度聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增仪购自美国Eppendorf公司,电泳仪购自北京市六一仪器厂,凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司;RHD基因外显子引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血型血清学试验检测ABO血型和Rh血型取受试者乙二胺四乙酸二钾抗凝全血2 mL,3 000 r·min-1离心5 min,将红细胞沉淀用生理盐水洗涤3次;吸取50 μL洗涤红细胞加入1 mL生理盐水中,并充分混匀,即得到5%红细胞悬液。采用试管法ABO正反定型试验检测ABO血型,采用试管法Rh抗原分型试验检测 Rh表型并初筛RhD阴性受试者,采用3个不同厂家的抗-D试剂通过间接抗人球蛋白试验对初筛RhD阴性受试者进行RhD阴性确认,最终检出 RhD变异型受试者。以上试验方法及结果判断标准均参照《全国临床检验操作规程》[3]。

1.3.2 PCR法扩增RhD变异型受试者RHD基因外显子取RhD变异型受试者的全血2 mL,加入乙二胺四乙酸二钾抗凝,使用全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,严格按照试剂盒说明书进行操作。采用PCR法扩增 RHD基因外显子E1～E10。PCR扩增体系为25.0 μL:样本DNA 0.8 μL,上、下游引物各0.8 μL,ddH2O 10.1 μL,2×PFU Master Mix 12.5 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,58～60 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸1 min,循环35次;最后72 ℃延伸5 min。RHD基因外显子E1～E10引物序列及相应PCR扩增退火温度见表1。取3 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,使用凝胶成像系统成像。根据DNA Maker条带和RHD基因外显子扩增产物的大小,观察相应的外显子区域有无特异性条带出现。

表1 RHD基因外显子E1～E10引物Tab.1 Exon E1-E10 primers of RHD gene

1.3.3 Sanger测序法检测RhD变异型的基因分型RhD变异型受试者的RHD基因外显子E1～E10的PCR特异性扩增产物由天津金唯智有限公司采用 Sanger测序法进行基因测序。应用SeqMan软件分析基因序列,根据单核苷酸多态性位点确定RhD变异型(弱D型、部分D型、DEL型)。

2 结果

2.1 血清学结果分析结果见表2。110 667名受试者中,初筛RhD阴性269例(0.24%)。269例初筛RhD阴性受试者中,Rh阴性256例(95.17%),RhD变异型 13例(4.83%)。256例RhD阴性受试者的ABO血型为A型78例(30.47%)、B型92例(35.94%)、O型64例(25.00%)、AB型22例(8.59%),Rh表型分布以ccdee(60.55%)和Ccdee(29.30%)居多。

表2 RhD阴性受试者的ABO和Rh表型分布频率Tab.2 ABO and Rh phenotypic distribution frequency of RhD negative subjects 例(%)

2.2 RhD变异型受试者RHD基因外显子PCR扩增产物特异性分析11例RhD变异型受试者的RHD基因外显子E1～E10为特异性条带;2例RhD变异型受试者的RHD基因外显子E1～E5、E8、E10为特异性条带。

2.3 RHD基因外显子的测序结果分析结果见表3。13例RhD变异型受试者中,7例弱D型、4例DEL型和2例部分D型。13例RhD变异型受试者RHD基因RhCE表型分别为CCee(2/13)、Ccee(6/13)和ccEe(5/13)。7例RhD变异型受试者等位基因RHD*15的E6外显子发生845 G>A杂合突变。4例RhD变异型受试者的E9外显子发生1 227 G>A杂合突变,其中1例受试者同时发生IVS7+152 C>A突变。2例RhD变异型受试者的RHD基因E6～E9外显子发生突变,被RHCE基因所取代,表现为RHD-CE(6-9)-RHD。

表3 RhD变异型受试者的RHD等位基因、突变位点及表型情况Tab.3 Mutation sites,genotypes and phenotypes of D variant subjects 例

3 讨论

Rh血型是一种较为重要的人类红细胞血型系统,RHD基因具有多态性,RHD基因编码表达的抗原在不同种族和地区分布具有较大的差异。Rh血型除了正常的D阳性和D阴性表型外,还包括D变异型(部分D、弱D、DEL)。目前已确认的D变异型等位基因达300多种,中国人中最常见的类型为RHD*15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1[4]。弱D型是中国华北地区的主要Rh变异型。部分D的氨基酸变异通常发生在胞外环区域,主要包括细胞外环错义突变、散在错义突变和RHD-CE-D融合基因[5]。RHD与RHCE基因约有96%的同源性,其外显子1、8、10核苷酸系列相同,外显子3、4、5、7、9有40个核苷酸的差异[6]。由于RHD与RHCE基因在同一条染色体上,位置相距较近且方向相反,染色体若发生折叠容易出现交换重组和形成RHD-CE-D融合基因。DEL类型在中国人群中以RHD 1227A和外显子9缺失为主,因其红细胞表面抗原密度极低,甚至达不到30个抗原表位[7],血清学试验容易误定为RhD阴性。

本研究共检测了新乡市中心血站 110 667 名无偿献血者的Rh血型,初筛RhD阴性269例(0.24%),通过间接抗人球蛋白试验进一步确认发现,RhD阴性256例(0.23%),与ZHANG等[8]报道的中国汉族人群中 RhD 阴性占比相似。本研究结果显示,新乡地区RhD阴性个体中,ABO血型为A型78例、B型92例、O型64例、AB型22例,Rh表型以ccdee(60.55%)和Ccdee(29.30%)居多,未发现 CCdEe、CCdEE和CcdEE表型,与西安地区Rh表型分布基本一致[9]。本研究共检出13例RhD变异型受试者,表型分别为CCee(2/13)、Ccee(6/13)和ccEe(5/13),进一步证实了RHC和(或)E等位基因与RHD 基因顺式串联可抑制D蛋白的表达[10]。本研究结果显示,7例弱D型受试者等位基因RHD*15的E6外显子发生845G>A杂合突变,表明第9跨膜区的282位甘氨酸突变为天冬氨酸,从而使红细胞表面的D抗原表位缺失。弱D15型的个体,在接受RhD阳性红细胞时发生同种免疫产生抗-D抗体[11],因此,该表型个体作为受血者时应视为Rh阴性。此外,本研究结果显示,4例受试者的RHD基因9外显子第 1 227 位发生G>A碱基突变,其中1例同时发生IVS7+152C>A突变,对应的等位基因分别为RHD*01EL.01和RHD*01EL.36。RHD 1 227G>A虽为无义碱基突变,但可影响mRNA 正常拼接,使RHD基因表达正常Rh(D)蛋白的效率降低[12]。

目前,部分国家已将RHD基因检测作为D阴性献血者首次献血的常规筛查方法[13]。在我国,汉族RhD阴性个体携带DEL表型约为23.3%[14]。因此,特别是针对怀有RhD阳性胎儿的DEL型孕妇,有必要把筛查DEL型纳入常规检测,从而为临床孕产妇的产前管理提供指导[15]。本研究中检测出2例部分D型RhD变异型受试者,等位基因型为RHD*DIV.3,其产生原因为RHD基因E6～E9外显子被RHCE基因取代,从而形成RHD-CE(6-9)-RHD融合基因。与常见的部分D融合基因RHD-CE(3-6)-D不一致,有关该类型的报道较少见,可能与献血者来源有关,本课题组考虑追踪该献血者及其家系血型基因型,以全面分析其基因多态性。

综上所述,新乡地区RhD阴性无偿献血者中Rh表型分布以ccdee和Ccdee居多,RhD变异型以弱D型为主,其RHD等位基因为RHD*15。掌握本地区Rh抗原分布特征及D变异型的等位基因类型,为临床开展基因型匹配输血治疗和构建本地区Rh血型资料库提供依据,从而保证临床用血的安全性和有效性。