CREB 通过调节突触可塑性调节记忆及与阿尔茨海默病的联系

罗卓慧庞 硕张连峰

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021;2.中国医学科学院神经科学中心,北京 100730)

环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein,CREB)是碱性区亮氨酸拉链(basic region-leucine zipper,bZIP)转录因子超家族的重要成员之一,定位于细胞核内,在脑组织的各种细胞中广泛表达。 CREB 基因与环腺苷酸反应元件调制器 ( cAMPresponsiveelement-binding modulator,CREM)和激活转录因子-1(activating transcription factor-1,AIF-1)两个同源基因共同构成CREB 转录因子家族[1]。 作为一种重要的转录因子,CREB 参与调节钙、神经营养因子、细胞因子信号通路以及各种细胞应激信号通路,通过调节神经元相关蛋白的表达调控单个神经元及整体神经通路的功能,主要调节分化、生存和可塑性,影响学习记忆,并与帕金森症、精神分裂症、酒精依赖、抑郁、焦虑等多种神经精神疾病的发生发展密切相关[1]。

1 CREB 的结构与激活

CREB 蛋白的主要结构域包括Q1 区、激酶诱导结构域(KID)区、Q2/CAD 区和亮氨酸拉链结构域(bZIP)区4 个区域。 位于蛋白C 端的基本结构域介导CREB 与DNA 结合,Q1 和Q2/CAD 两个结构域含有丰富的谷氨酰胺,bZIP 区介导与DNA 的结合和二聚化,其他的区域促进CREB 与激活子或转录复合物结合。 KID 区的Ser-133 残基磷酸化后与转录激活子CREB 结合蛋白(CREB binding protein,CBP)结合,在内在或相关的乙酰基转移酶的作用下CREB 与核心转录机器相互作用诱导转录进行,该过程可持续数小时[2],Ser-133 位点是CREB 激活的标志,研究发现Ser-133 位点激活的CREB 对转录调控,继而调节基础神经传输,突触可塑性和空间认知发挥了不可或缺的作用。 CREB S133A 突变小鼠在空间认知,神经传输和神经电位等方面表现出明显的缺陷[3],而Ser-142 位点磷酸化后促进CREB二聚体解聚,抑制转录[4]。 回文序列“TGACGTCA”是cAMP 反应元件,可被CREB 特异性识别。 不同物种的CRE 序列存在差异,但“CGTCA”序列相对保守[1]。

兴奋性神经递质、神经生长因子、G 糖蛋白偶联受体(G-PCRs)配体和压力等可激活CREB 的磷酸化,常见的激活CREB 磷酸化的通路按来源可分为cAMP 信号通路、钙离子信号通路、生长因子诱导和压力诱导的信号通路,包括Ca/CaM/CaMK/CREB、GPCRs/AC/cAMP/PKA/CREB、 RTK/Ras/ERK/RSK/CREB 和RTK/PI3K/AKT/CREB 信号通路等[2],近年来又发现PPARα/CREB[5-6]和CCR5/CREB 通路[7]。 蛋白磷酸酶(protein phosphatase 1,PP1)是CREB 最主要的磷酸酶,抑制CREB 活性[1,4]。 除磷酸化修饰外,研究发现CREB 还存在糖基化修饰,阻断CREB 的糖基化可增强神经元轴突和树突生长,促进长期记忆巩固[8]。

CREB 是转录因子网络的重要组成部分,CREB介导的转录受转录激活子和抑制子共同调节,CREB的转录激活子包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、CREB 调控的转录辅激活因子(CREB regulated transcription activator 1, CRTC1)和CREB结合蛋白(CREB binding protein, CBP)。 AP-1 是亮氨酸拉链蛋白Fos 和Jun 的异二聚体,通过调节CREB 的转录水平调节突触强度和突触数目间接调节突触可塑性,CREB 又可正反馈调节AP-1 的表达[9]。 静息状态下神经元中的CRTC1 定位于突触上,在局部刺激下CRTC1 被钙流或钙调磷酸酶激活,迅速转移至核内,与喂食状态感应核受体(fedstate sensing nuclear receptor, FXR) 竞争性结合CREB[10]。 CRTC1 的核内表达受cAMP 调节[11],CRTC1 与CREB 的bZIP 区结合,促进CREB 与DNA 二聚化结合可激活CREB 的非磷酸化状态[12]。CBP/p300 具有组蛋白乙酰转移酶活性,与CREB 的KID 区结合并与和Ser133 位点相互作用[12],通过招募p53、ATF-1、ATF-2、junB、c-myc、E2F、c-jun 等转录因子介导转录[13]。

2 CREB 的下游目标基因

CREB 被多种信号通路激活后,可在T 细胞、肝细胞和精母细胞的分化等长期适应过程中发挥作用。 已确定的CREB 目标基因超过100 种,这些基因在结构上含有一个或多个CREB 结合位点,影响核转录、信号转导、神经传输、代谢、细胞增殖与生长、细胞结构等方面[2,14]。

CREB 可通过调节下游基因调节突触可塑性。一方面,CREB 可激活一系列突触可塑性相关基因包括BDNF、NGF、tPA、Arc、PPARGC1、PLCγ、VGF等[15]。 BDNF 和NGF 是神经营养因子,在发育过程中支持神经元和神经突生长,共同调节细胞凋亡、细胞连接、纤维引导和突触形态。 BDNF 在海马体中指导神经发生,在突触前和突触后位置发挥旁分泌因子和自分泌因子的作用,促进血清素和多巴胺的传递。 体内和体外研究发现BDNF 可促进神经递质释放,突触传输和LTP[16]。 作为一种神经保护因子,BDNF 对许多神经和精神疾病都具有治疗潜力[17]。 BDNF 调节中枢神经系统的发育与可塑性,在LTP 中通过增加突触囊泡的释放调节突触的结构和功能,表现为长期调节作用[18]。 NGF 通过调节胆碱能系统调节LTP[19]。 tPA 是细胞外丝氨酸蛋白酶,促进纤溶酶原转化为纤溶酶,纤溶酶可降解部分细胞外基质,通过调节谷氨酸受体增加谷氨酸诱导的钙离子内流,增加PKA 活性[18]。 Arc 是一种立早基因(immediately early genes, IEG),通过调节AMPA 型谷氨酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazopropionic acid receptor,AMPAR)的转运和细胞骨架调控突触强度[20]。 线粒体定位于神经元轴突末梢和树突,是真核细胞内的负责能量供给和钙缓冲细胞器,调节钙和氧化还原信号,与LTP 的发生与维持密切相关[21],PPARGC1 是调节线粒体融合的重要基因,促进形成缓慢的氧化纤维,影响线粒体发生和突触形成[21]。 PLCγ 通过被TrkB 招募,激活下游突触可塑性信号通路,主要维持海马内树突形态与棘突收缩功能[21-23],VGF 是一种分泌多肽,在神经细胞和神经内分泌细胞中均表达,定位于胞体与突触内,剂量依赖性增加突触电位[24]。

另一方面,许多目标基因自身就是转录因子,如C/EBPβ、Egr1、Nurr1 等,这些基因对神经功能表现为间接调节作用[14]。

3 CREB 通过调节突触可塑性调控记忆

突触可塑性是中枢神经系统参与感知、学习和记忆的细胞基础[25-27],突触前膜释放神经递质触发突触后膜的能力称为突触效能,受到刺激时突触效能的变化称为突触可塑性[27],常见的突触刺激包括学习记忆、环境变化和脑损伤[28]。 突触可塑性改变时,突触前后的神经传输和膜转运情况均改变,相关蛋白合成或激活,细胞骨架重塑,突触可塑性在神经元层面上表现为突触发生和棘突生长[28],在电位上表现为长时程增强(long-term potential,LTP)和长时程抑制(long-term depression,LTD)两种。 LTP和LTD 的诱导,表达和相互作用依赖相关突触蛋白基因的转录与翻译和树突骨架的重塑[29]。 按照突触效能变化的持续时间突触可塑性可分为短期突触可塑性(持续几毫秒至几分钟)和长期突触可塑性(持续超过几十分钟)[27]。 突触效能变化的第一阶段细胞内仅对现有的蛋白进行修饰,第二阶段转录并合成新的蛋白[30]。

记忆是重要的神经活动,包括短期记忆和长期记忆两种,短期记忆立即形成,长期记忆形成缓慢但是相对短期记忆更稳固,需要合成相关mRNA 和蛋白质[31]。 记忆在海马区中的形成,在大脑皮层中的巩固,在记忆形成的不同阶段突触可塑性发挥的作用表现为时空特异性[32]。 研究发现与青年的对照组小鼠相比老年小鼠突触可塑性明显下降,树突的棘突数目减少,生物反应路径分析(ingenuity pathway analysis, IPA)结果表明CREB 在该突触可塑性神经网络中占据中心位置,相比青年对照组小鼠,老年小鼠CREB 的表达明显下调[33]。 由反义寡核苷酸,RNA 干扰和基因突变等导致CREB 表达下调时,将导致记忆缺陷,影响回忆功能。 相反,CREB表达增加时,记忆增强[34]。

CREB 通过调节突触可塑性调节记忆,主要影响长期记忆。 研究发现抑制海马CA1 区CREB 转录因子家族基因后,与对照组相比小鼠短期记忆无明显差异,长期记忆和空间记忆受损[31]。 CREB 已被证明是参与小鼠、大鼠、海兔、果蝇等多种动物长期记忆的重要转录因子[18],CREB 对突触可塑性的调节作用表现在以下几个方面:(1)影响离子流,CREB 激活后调控电压门控Na+-K+通道的开放,钠离子流增加,钾离子流减少。 (2)影响递质释放,CREB 激活后突触前膜神经递质的释放增加,突触效能增加[35]。 (3)影响神经元兴奋性,研究发现相比野生型细胞相同强度的电脉冲在CREB 过表达细胞引发更高的动作电位及更低的动作电位后超极化,CREB 激活后海马区谢氏侧支神经元L-LTP 增加[36],神经元兴奋性增加,海马CA1 区神经元产生L-LTP 所需要的刺激阈值降低[18]。 (4)影响树突的棘突形成,抑制CREB 后棘突数目减少[18]。 (5)影响与可塑性相关基因的转录,进而调控相关生理过程[18]。 CREB 通过调节固有神经元的兴奋性的影响神经元进入记忆轨迹的可能性,增加IEG 的表达,促进记忆相关基因的转录,实现对记忆的分配与调控[34,37]。 当环境发生变化时,CREB 参与皮层的躯体感觉和运动通路的重新投射,增加轴突数目和神经元棘突数目,诱导回路中新连接的形成,在脑卒中恢复中发挥重要作用[38]。

4 CREB 与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的关系

研究发现CREB 不仅调控许多神经可塑性相关基因的转录,还调控AD 相关蛋白的表达。 受CREB调控的淀粉样前体蛋白胞内结构域相关蛋白(ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 1B,AIDA-1)主要分布在突触后密度区域(post synaptic density,PSD)。 AIDA-1 基因的转录受CREB 调控[39],是迟发型AD 的候选风险基因[40]。一方面,AIDA-1 通过下调γ-分泌酶降低Aβ 分泌,降低Aβ 含量[39],另一方面,AIDA-1 是突触后密度蛋白(discs large MAGUK scaffold protein 4,PSD95)/N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)复合物的结合蛋白,在NMDAR 介导的突触传输和可塑性中必不可少,AIDA-1 失活导致海马依赖的突触传输缺陷,AIDA-1 基因敲除小鼠活动性增加,前脉冲抑制,出现刻板行为[40]。

AD 患者表现出严重的认知和记忆恶化[41],突触可塑性损伤, 神经元内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs),胞外淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)沉积和神经元大量死亡,海马CA1 和CA3 区椎体神经元密度降低和神经元树突棘密度降低是AD 早期的重要病理表型之一,这些突触异常是由可溶性Aβ 寡聚体(Aβ oligomers,AβOs)积聚和 过 度 磷 酸 化 的 微 管 相 关 蛋 白 tau( hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau,HPtau)引起[29]。 AβOs 与突触后膜的NMDAR 结合,诱导谷氨酸兴奋毒性,扰乱谷氨酸再摄取及表面AMPAR 的去除,导致线粒体损伤,氧化应激和钙离子稳态失衡,产生的突触毒性最终导致细胞死亡[42]。 以Tg2576、PDAPP、APP/PS1、J20、3×Tg、5×FAD 为代表的AD 转基因小鼠模型表现出明显的突触可塑性损伤,LTP 受损[43]。 Tau 通过调控微管结合域与微管蛋白的结合调控微管动力学,Tau 异常时抑制神经元生长和轴突延伸,微管密度降低,HPtau 从微管上解离,形成神经纤维缠结,损害正常的树突结构[44]。 AD 患者脑内CREB 和磷酸化的CREB(phosphorylated CREB,P-CREB)的表达均下降[45],AD 常见动物模型APP/PS1 小鼠3 月龄P-CREB 明显下调[46],3×Tg 小鼠CREB 和P-CREB表达明显下降[47]。 Aβ 病理假说是AD 重要的病理假说之一,体外研究发现Aβ42诱导的神经元PCREB 表达下降[45,47],AβOs 诱导的神经元P-CREB表达下降[13]。 Aβ 通过下调NO/cGMP/cGK/CREB通路损伤突触可塑性,影响学习记忆功能[48]。

CREB 与AD 联系密切,且AD 表现的突触可塑性损伤先于Aβ 沉积和NFTs 病理表型出现,可能是可逆的[29],因此CREB 可能是AD 潜在的治疗靶点之一。 某些磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesterase inhibitor,AChEI)已被发现可通过维持或激活CREB的Ser-133 位点磷酸化改善认知功能。 PDE 的主要功能是水解cAMP 和cGMP。 部分PDE 抑制剂通过促进抑制PDE,提高cAMP 和cGMP 的含量,激活CREB 进而改善长期记忆缺陷和认知障碍[49]。PDE4 抑制剂罗利普兰在APP/PS1 小鼠中通过激活cAMP/PKA/CREB 通路,改善LTP 缺陷,改善条件性学习和长期空间学习记忆[50]。 在高脂饮食和低剂量四氮唑诱导的SD 大鼠糖尿病认知缺陷模型中,罗利普兰可改善长期的空间记忆,提高P-CREB和突触相关蛋白BDNF、ARC 的表达[53]。 研究发现衰老后PDE5 抑制剂(PDE5 inhibitors,PDE5Is)的活性和表达增加[48]。 以米罗那非为代表的PDE5Is 通过激活cGMP/PKG/CREB 通路增加LTP,减少细胞凋亡,HPtau 和Aβ 表型,改善认知功能[48,52]。 除PDE 抑制剂外,阿司匹林已被证明可与PPARα 结合,在5×FAD 小鼠中通过激活PPARα/CREB 通路激活钙离子内流,加强下游BDNF,PSD95 和NR2A的表达,增加棘突的数目和密度[5]。 组胺H3 受体(H3 receptor,H3R)抑制剂塞普酰胺可通过激活CREB 介导的自噬途径和溶酶体途径,减少APP/PS1 小鼠缺血性损伤和神经元损伤,改善认知功能,在原代细胞模型可明显改善Aβ 病理表型[53]。 三环类抗抑郁药地昔帕明在AD 大鼠中通过上调PCREB 改善认知障碍[42]。 糖皮质激素受体抑制剂米非司酮可改善3×Tg 小鼠的认知缺陷,减少营养不良的神经突数目,改善Aβ 和HPtau 病理表型,并上调CREB 和P-CREB 的表达[47]。

5 结果和展望

现有的抗AD 药物包括AChEI(多奈哌齐、利伐斯的明、加兰他敏),NMDAR 抑制剂(美金刚)和基于Aβ 病理表型的药物阿杜那单抗。 以上药物可缓解AD 症状,已被批准上市,但目前没有药物可彻底延缓AD 的发病进程。 现有的AD 治疗措施不足,AD 发生发展机制依旧不明,发现更多有潜力的AD靶点,并针对特定的靶点进行药物研发,是AD 治疗的研究方向之一。 CREB 是与突触可塑性密切相关的蛋白,AD 患者CREB 表达和活性均抑制,表现出明显的记忆缺失,认知缺陷和突触可塑性损伤。 本文总结CREB 的结构与功能,归纳了CREB 通过调节突触可塑性对记忆的调节作用及CREB 激活对认知障碍的改善作用。 在一定范围内通过调节CREB实现对突触可塑性的调节,在避免兴奋毒性的前提下改善突触间信息传递,CREB 的直接或间接激活剂或许是AD 潜在的治疗措施。