鲜枸杞子浆质量标准研究*

田 雨，王 庆，齐喜红，韩 莎

（1. 宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004； 2. 宁夏回族自治区药品检验研究院，宁夏 银川 750001）

枸杞子为药食同源的常用滋补类中药［1］，始载于《神农本草经》［2］，现收载于2020年版《中国药典（一部）》，具有滋补肝肾、益精明目功效［3］。枸杞子含有丰富的化学成分，主要有枸杞多糖、生物碱、氨基酸、黄酮类、维生素、微量元素［4-6］等。鲜枸杞子浆是结合现代科技，将枸杞子鲜果经破碎、制浆及灭菌工艺灌装生产而成，最大限度地保留了枸杞子鲜果的药效成分，同时便于运输、储存和使用。近年来，鲜枸杞子浆作为食品已有应用，其标准为食品行业团体标准［7-9］。为传承、创新枸杞子中药饮片传统炮制加工方法，提升其生物利用度，拓宽鲜枸杞子浆在中药领域的应用，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对鲜枸杞子浆进行定性鉴别，分别采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法测定枸杞多糖及甜菜碱的含量，为建立鲜枸杞子浆的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

XS205型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为十万分之一）；2550 型紫外分光光度计（日本岛津公司）；安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

1.2 试药

枸杞子浆（宁夏早康生物科技有限公司，批号分别为20191001，20191002，20191003，20191004，20191005，20200701，20200702，20200703，20200704，20200705）；枸杞子对照药材（批号为121072-201611），D-无水葡萄糖对照品（批号为110833-201908，纯度为99.8%），甜菜碱对照品（批号为110894 - 201604，纯度为99.2%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

取样品2.0 g，加水35 mL，加热煮沸15 min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15 mL 振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。取枸杞子对照药材0.5 g，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。吸取供试品溶液和对照药材溶液各5 μL，用自动点样仪分别点在同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1，V/V/V）为展开剂，上行展开，展距8.0 cm，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相同位置显相同颜色的荧光斑点。色谱图见图1。

图1 薄层色谱图（365 nm）1.Reference medicinal materials solution 2-4.Test solutionFig.1 TLC chromatogram（365 nm）

2.2 枸杞多糖含量测定

2.2.1 溶液制备

取D-无水葡萄糖对照品25.11 mg，精密称定，置250 mL 容量瓶中，加水定容，即得对照品溶液。取样品2.0 g，精密称定，加乙醚100 mL，加热回流1 h，弃去乙醚液，残渣加100 mL 80%乙醇，加热回流提取1 h，滤过，用30 mL 80%乙醇分次洗涤，将滤渣和滤纸置装有150 mL 水的烧瓶中，继续加热回流提取2 h，趁热滤过，用少量热水冲洗滤器，收集滤液和洗液，放冷，转移至250 mL 容量瓶中，加水稀释并定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.2 标准曲线制备［10-12］

精密量取2.2.1 项下对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5 mL，分别置具塞试管中，加水至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，40 ℃水浴放置15 min，取出，迅速冷却至室温，以溶剂为空白对照，于490 nm 波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/ mL）为横坐标绘制标准曲线，得线性方程Y=0.072X- 0.026 4（r= 0.999 8，n= 6）。结果表明，D-无水葡萄糖质量浓度在2.506 0～18.794 8 μg/ mL 范围内与吸光度线性关系良好。

2.2.3 样品含量测定方法

精密量取供试品溶液1.0 mL，置具塞试管中，精密加水1.0 mL，按2.2.2 项下自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度，按标准曲线计算供试品溶液中D-无水葡萄糖的浓度和含量。

2.2.4 方法学考察

精密度试验：精密量取D-无水葡萄糖对照品溶液0.4 mL，置具塞试管中，加水至2.0 mL，按2.2.3项下方法测定吸光度6 次。结果的RSD为0.11%（n= 6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20191001）样品6份，按2.2.1 项下方法制备供试品溶液，按2.2.3 项下方法测定吸光度，并计算含量。结果平均含量为0.81%，RSD为1.28%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20191001），按2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0，2，4，6，8 h时按2.2.3项下方法测定吸光度。结果供试品溶液在室温下放置6 h的吸光度无明显变化，RSD为0.63%（n=4），表明供试品溶液在6 h 内稳定性良好；放置8 h 后吸光度下降，RSD为2.83%（n=5）。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20191001）0.25 g，精密称定，共6 份，分别精密加入D-无水葡萄糖对照品2 mg，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.2.3项下方法进样测定，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 枸杞多糖加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test of lycium burbarum polysaccharide（n=6）

2.2.5 样品含量测定

取10 批样品，按2.2.1 项下方法制备供试品溶液，按2.2.3项下方法进样测定，并计算含量。结果见表2。

表2 样品中枸杞多糖含量测定结果（%）Tab.2 Results of the content determination of lycium burbarum polysaccharide in samples（%）

2.3 甜菜碱含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Merck Purospher@STAR NH2柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈- 水溶液（85∶15，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：195 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2 溶液制备

取甜菜碱对照品17.68 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加水稀释并定容，摇匀，作为对照品溶液。取样品4 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，冷却，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置碱性氧化铝固相萃取柱（2 g）上，加乙醇30 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水适量，溶解，转移至2 mL容量瓶中并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液［13-14］。同法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：取2.3.2 项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱同一保留时间处有相应色谱峰，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图1.BetaineA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取对照品溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，按2.3.1项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y =1.952 7X -9.219 0（r= 0.999 6，n= 5）。结果表明，甜菜碱质量浓度在17.54～350.77 μg/ mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.3.2 项下对照品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD为1.50%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20191001）样品6份，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果的RSD为1.10%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.3.2 项下对照品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h 时按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.94%（n=7），表明甜菜碱在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20191001）2 g，精密称定，共6 份，分别精密加入质量浓度为3.761 7 mg/ mL 的甜菜碱对照品溶液1 mL，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表3。

表3 甜菜碱加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of betaine（n=6）

2.3.4 样品含量测定

取10 批样品，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表4。

表4 样品中甜菜碱含量测定结果（%）Tab.4 Results of the content determination of betaine in samples（%）

3 讨论

本研究中鲜枸杞子浆的TLC 鉴别主要参考2020年版《中国药典（一部）》枸杞子TLC鉴别项下的方法［3］，同时考察了不同薄层板、不同温湿度对试验结果的影响，结果重复性良好，操作简便，斑点清晰，分离效果好。故确定为2.1项下鲜枸杞子浆TLC鉴别方法。

在190～680 nm 波长范围内扫描，结果于490 nm波长处葡萄糖吸收峰最大，故选用490 nm 为枸杞多糖的测定波长。考察了样品在不同提取时间（2，3，4 h）所测得的枸杞多糖含量，结果分别为0.82%，0.83%，0.84%。综合考虑，确定样品提取时间为2 h。考察了比色皿、波长和苯酚试剂的耐用性，结果均无明显影响。

从鲜果炮制成鲜枸杞子浆的收率为80%～90%，从鲜果炮制成枸杞子的收率为20%～25%，即鲜枸杞子浆与枸杞子干品比率为4∶1。参照2020年版《中国药典（一部）》枸杞子含量测定项下枸杞多糖的限度为不得少于1.8%，结合10 批样品的含量测定结果，暂将鲜枸杞子浆中枸杞多糖的限度订为不得少于0.5%。

考察了流动相乙腈- 水溶液的3 种比例（87∶13，85∶15，83∶17，V/V），结果均符合要求。考察了不同品牌色谱柱（Merck Purospher@STAR NH2柱、Agilent NH2柱、Waters NH2柱，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm）对甜菜碱含量测定结果的影响，结果对甜菜碱含量测定结果影响较小，故最终确定为2.3.1项下色谱条件。结合10批样品的甜菜碱含量测定结果，暂将鲜枸杞子浆中甜菜碱的限度订为不得少于0.10%。

综上所述，本研究中建立的方法简便、可行、重复性好，可用于鲜枸杞子浆的质量控制。