生肌化瘀凝胶质量标准研究*

2023-05-11张玉萱徐玲玲刘爱军单陈伟廖雪清

中国药业 2023年9期

张玉萱，徐玲玲，刘爱军，单陈伟，廖雪清

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437）

生肌化瘀凝胶以黄芪、丹参为君药，可益气补血、扶正祛邪；以大黄、血竭、白芷为臣药，可祛瘀定痛、敛血生肌；以紫苏为佐药，可行气止痛；以珍珠粉、炉甘石为使药，可收湿敛疮、去腐生肌。诸药配伍，有祛瘀生肌、活血消瘢、扶正祛邪之功效［1-3］。目前，关于生肌化瘀凝胶质量标准的研究鲜有报道。网络药理学分析表明，生肌化瘀凝胶可能通过多成分、多靶点对慢性皮肤溃疡起到治疗作用，方中主要药物为大黄、血竭［4］。但该方药味组成与化学成分复杂，化学物质基础尚不明确，故需建立标准化的质量控制方法，确定主要化学成分，明确药效物质基础。本研究中采用薄层色谱（TLC）法和高效液相色谱（HPLC）法对生肌化瘀凝胶进行质量控制研究，以保障临床用药安全、有效，为后续新药的开发提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent - 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；52-CS RE型系列旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；H.H.S-4 型电热数字显示恒温水浴锅，DHG-9071型电热恒温鼓风干燥箱，均购自上海圣欣科学仪器有限公司；Sartorius BL310 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，精度为0.000 1 g）。

1.2 试药

血竭素高氯酸盐对照品（批号为110811-201506，纯度为99.0%），大黄酚对照品（批号为110796 -200309，纯度为99.0%），均购自中国食品药品检定研究院；欧前胡素对照品（批号为14073021，纯度为98.0%），丹参酮ⅡA对照品（批号为14072844，纯度为98.0%），紫草素对照品（批号为14071521，纯度为98.0%），黄芪甲苷对照品（批号为16053121，纯度为98.0%），均购自Shanghai Tauto Biotech 公司；生肌化瘀凝胶（医院制剂，上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药学研究室）；乙腈（色谱纯，批号为20210310），甲醇（色谱纯，批号为20210514），乙酸乙酯（分析纯，批号为T20110922），均购自国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷（批号为20131017），甲酸乙酯（分析纯，批号为20121112），环己烷（批号为20120916），均购自上海凌峰化学试剂有限公司；石油醚（分析纯，上海润捷化学试剂有限公司，批号为20161001）；氢氧化钾（上海精化科技研究所，批号为20041020）；甲苯（上海和逸化学试剂有限公司，批号为2016117）；氨水（批号为2012201），甲酸（分析纯，批号为20130202），均购自江苏强盛功能化学股份有限公司；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 样品制备

取泊洛沙姆、聚乙二醇、氮酮各适量，置烧杯中，加入适量纯化水，室温放至澄清，加入生肌化瘀方提取液，混匀，调节pH值，即得样品，共6批，分别编号为1-6。

2.2 TLC 鉴别

血竭［5］：取样品2.5 g，加入30 mL 甲醇，水浴，滤过，再加甲醇定容至25 mL，取10 mL 蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取血竭素高氯酸盐对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；按样品制备方法制备不含血竭的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。吸取上述溶液各10～20 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷- 甲醇（19∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 A。

大黄［6-7］：同法制备供试品溶液；另取大黄酚对照品适量，加甲醇溶解，即得对照品溶液；按样品制备方法制备不含大黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。分别吸取上述溶液各2～4 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚- 甲酸乙酯- 甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置紫外光灯（365 nm）下显相同颜色的荧光斑点；经氨蒸气熏蒸后，日光下可见斑点变红，且阴性对照无干扰。色谱图分别见图1 B1和图1 B2。

丹参［8-9］：同法制备供试品溶液；另取丹参酮ⅡA对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；按样品制备方法制备不含丹参的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。分别吸取上述溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷- 甲苯- 乙酸乙酯-甲醇- 甲酸（6∶4∶8∶1∶4，V/V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 C。

图1 薄层色谱图1.Reference solution 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionA.Draconis Sanguis（365 nm） B1，B2.Rhei Radix et Rhizoma（365 nm，sunlight） C. Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（365 nm） D.Arnebiae Radix（sunlight） E1，E2.Astragali Radix（sunlight，365 nm） F.Angelicae Dahuricae Radix（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

紫草［10-11］：同法制备供试品溶液；另取紫草素对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；按样品制备方法制备不含紫草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。分别吸取上述溶液各4 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷- 甲苯- 乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置显相同的紫红色斑点，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液后斑点变蓝，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 D。

黄芪［12-13］：同法制备供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；按样品制备方法制备不含黄芪的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。分别吸取上述溶液各2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置日光下显相同棕褐色斑点，紫外光灯（365 nm）下显橙黄色荧光斑点，且阴性对照无干扰。色谱图分别见图1 E1和图1 E2。

白芷［14-15］：取样品2 g，加10 mL 乙醚，浸泡1 h，不时振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取欧前胡素对照品，加乙酸乙酯溶解，即得对照品溶液；按样品制备方法制备不含白芷的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。分别吸取上述溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚-乙醚（3∶2，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置显相同蓝色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 F。

2.3 含量测定［16-17］

2.3.1 色谱条件

1）血竭素。色谱柱：Agilent Zorbax - SB - C18柱（250 mm×4.6 mm，15 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（50∶50，V/V）；流速：1 mL/ min；检测波长：440 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

2）大黄酚。色谱柱：Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2 溶液制备

血竭素：取血竭素高氯酸盐对照品8.9 mg，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加3%磷酸甲醇定容，配制成质量浓度为0.178 mg/mL 的对照品溶液Ⅰ，即每1 mL 含血竭素0.129 3 mg。取样品2.5 g，精密称定，置50 mL烧杯中，加30 mL 3%磷酸甲醇，40 ℃水浴加热，过滤提取液，加3%磷酸甲醇定容至50 mL容量瓶中，再经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅰ。按处方工艺，除去血竭药材，制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

大黄酚：取大黄酚对照品5 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液Ⅱ。取样品2.5 g，精密称定，置5 mL 容量瓶中，加纯化水定容，摇匀，滤过，精密吸取1 mL，置2 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，离心（转速为3 000 r/min）5 min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅱ。按处方工艺，除去大黄药材，制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.3.2 项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.3.1 项下色谱条件进样测定。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有对应色谱峰出现，且阴性对照无干扰。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图1.Draconin 2.ChrysophanolA.Reference solution B.Test solution C1，C2.Negative reference solution（lack of Draconis Sanguis and Rhei Radix et Rhizoma respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：1）血竭素。分别精密吸取2.3.2 项下对照品溶液Ⅰ200，300，400，500，600，700 μL，置1 mL容量瓶中，加3%磷酸甲醇定容，制备成含血竭素0.025 85，0.038 77，0.051 70，0.064 63，0.077 55，0.090 48 mg/mL的系列标准品溶液。按2.3.1项下色谱条件进样测定，以标准品溶液质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=3 165.650 1X-14.435 2（r=0.999 9，n=6）。结果表明，血竭素质量浓度在0.025 85～0.090 48 mg/mL 范围内与面积线性关系良好。2）大黄酚。分别精密吸取2.3.2 项下对照品溶液Ⅱ100，400，800，2 000，4 000，6 000 μL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成质量浓度分别为0.001，0.004，0.008，0.020，0.040，0.060 mg/mL 的系列标准品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，以标准品溶液质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y= 40 807X+ 7.347 5（r=0.999 9，n=6）。结果表明，大黄酚质量浓度在0.001～0.060 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

日内精密度试验：分别吸取2.3.2项下对照品溶液Ⅰ，Ⅱ各10 μL，按2.3.1 项下色谱条件1 d 内进样测定5 次。结果血竭素、大黄酚峰面积的RSD分别为2.30%和0.48%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1 项下样品适量，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液Ⅰ，Ⅱ，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h 时按2.3.1 项下色谱条件进样测定。结果血竭素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.23%和0.23%（n= 8），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取2.1 项下样品适量，平行5 份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液Ⅰ，Ⅱ，按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果血竭素、大黄酚含量的RSD分别为0.86%和0.98%（n=5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别精密吸取已知含量的供试品溶液Ⅰ，Ⅱ各适量，共9 份，分别精密加入80%，100%，120%的对照品溶液Ⅰ，Ⅱ，混匀，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，并计算加样回收率。结果血竭素、大黄酚的平均加样回收率分别为101.88%和96.82%，RSD分别为2.50%和0.79%（n=9），表明方法准确度良好。

2.3.4 样品含量测定［18-19］

取6 批（编号为1-6）样品，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液Ⅰ，Ⅱ，按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表1。

表1 6批样品中血竭素和大黄酚含量测定结果Tab.1 Results of the content determination of draconin and chrysophanol in samples

3 讨论

3.1 TLC 鉴别

2020年版《中国药典（一部）》中有血竭、大黄、丹参、紫草、黄芪、白芷的TLC鉴别方法，但因不同剂型、不同制备方法及不同药物间相互作用的影响，操作方法不能完全应用于生肌化瘀凝胶。曾比较药典方法与文献［6-15］报道的方法，最终建立2.2项下TLC鉴别方法。

3.2 流动相系统选择

本研究中对大黄酚的含量进行了测定，流动相分别考察了乙腈- 0.1%磷酸水溶液、甲醇- 0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V），结果乙腈- 0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）的分离效果差，且调整比例无明显改变；流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）时色谱峰峰形好，分离度良好，出峰时间理想。故流动相最终选择甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V），该条件下系统基线平稳，各色谱峰间分离度好，响应值较高。