天麻素抗偏头痛作用机制的网络药理学与分子对接研究*

杨 杰，郭步伐，龙 盼，李 沙

（毕节医学高等专科学校基础医学系，贵州 毕节 551700）

天麻素是天麻的主要有效成分，是天麻质量控制的指标性化合物，具有镇痛镇静、抗惊厥、神经保护、改善学习记忆、降压、抗凝、抗血小板聚集等药理作用［1-2］。这与天麻祛风通络、平抑肝阳、息风止痉的功效密不可分，临床可用于治疗偏头痛。回顾经典的中医古方，治疗偏头痛频次达50 次以上的中药为川芎、白芍、天麻、当归、白芷和甘草，故天麻主要成分天麻素治疗偏头痛的临床价值值得进一步挖掘［3］。网络药理学是系统生物学的一门分支学科，可从整体观角度阐释中药及中药复方治疗疾病的关键分子通路［4-7］。本研究中以天麻主要有效成分单体天麻素为核心展开研究，遵循《网络药理学评价方法指南》［8］，在天麻素治疗偏头痛疗效确切的基础上，通过网络药理学与分子对接技术筛选天麻素抗偏头痛的关键分子通路及关键靶点，为临床应用提供分子机制基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 网络药理学研究

收集天麻素抗偏头痛靶点：在TCMSP 数据库（https：// old. tcmsp. e. com/ index. php）中获取天麻素的化学结构；在SwissTargetPrediction 数据库（https：//www.SwissTargetPrediction.cn/）中选择的物种为“人”，获取天麻素的作用靶点，以靶基因的缩写表示；在GeneCards数据库（https：// www. genecards. org/）中以“migraine”为关键词搜索偏头痛相关靶点，通过R 3.6.2 软件绘制维恩图，取天麻素靶点与偏头痛相关靶点的交集，即得天麻素抗偏头痛共有靶点。

构建蛋白互作（PPI）网络（天麻素抗偏头痛靶点网络）：将分析得到的天麻素抗偏头痛靶点导入String 数据库（https：// www. string - db. org/），选择物种为“人”，输出天麻素抗偏头痛靶点网络图，保存.tsv 格式文件，并输入R 3.6.2 软件，进行条形图分析，并计算网络中节点自由度值，揭示其核心靶点。

GO 生物过程富集分析与KEGG 通路富集分析及靶点- 通路网络：通过R 3.6.2 软件，将天麻素抗偏头痛靶点基因的缩写转换为基因ID，经R 3.6.2 软件进行GO 生物过程富集分析与KEGG 通路富集分析，筛选富集P值较显著的信号通路，并用条形图表示。从上述分析中筛选出富集显著的20 条信号通路与30 个靶点，经Cytoscape 3.9.1 软件构建靶点- 通路网络，体现天麻素治疗偏头痛多靶点、多途径的整体效应。

1.2 分子对接验证

经PPI 网络与靶点- 通路网络共同显示天麻素抗偏头痛核心靶点，并进行天麻素与核心靶点的分子对接验证，其操作过程如下。1）经Chem3D 软件，将天麻素2D 结构（. sdf 格式文件）转化为3D 结构（. mol2 格式文件）；2）在PDB 数据库（http：// www. rcsb. org/）中下载靶点3D结构（.pdb格式文件），并经PyMOL 软件去除水分子和小分子配体；3）在AutoDockTools 1.5.6 软件中导入靶点的3D 结构，输出. pdbqt 格式文件，输入天麻素.mol2 格式文件，导出天麻素.pdbqt 格式文件，运行Grid 模块，设置天麻素与靶点对接的活性口袋；4）运行AutoDock_vina 1.1.2 分子模拟软件进行分子对接，用结合能评价化合物与受体的匹配情况，用PyMOL 软件绘制最佳匹配结果图。

2 结果

2.1 天麻素抗偏头痛靶点

在GeneCards 数据库中以关键词“migraine”搜索到偏头痛相关靶点3 081 个，并与103 个天麻素作用靶点取交集，得到天麻素抗偏头痛共有靶点50个。详见图1。

图1 天麻素与偏头痛共有靶点的维恩图Fig.1 Venn diagram of common targets of gastrodin and migraine

2.2 构建天麻素抗偏头痛靶点的PPI 网络

将50个共有靶点输入String数据库，得到天麻素抗偏头痛靶点的PPI 网络，提示靶点与靶点的相互作用。靶点相互作用的节点数越多，自由度值越高，表明该靶点在此网络中所处核心地位就越高。自由度值排前30的靶点的PPI网络条形图见图2。

图2 天麻素抗偏头痛靶点的PPI网络条形图Fig.2 PPI network histogram of targets related to gastrodin against migraine

2.3 GO 生物过程富集、KEGG 通路富集及靶点- 通路网络构建

GO 生物过程富集分析显示（图3），富集P值较显著的生物过程为内肽酶活性、碳酸盐脱水酶活性、水裂解酶活性、碳氧裂解酶活性、裂解酶活性、金属内肽酶活性、涉及细胞凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性、胰岛素受体底物结合、胰岛素样生长因子Ⅰ结合、寡聚糖，结合的富集靶点数量分别为10个、8个、8个、8个、8个、5 个、4 个、3 个、3 个、3 个。进一步对50 个天麻素抗偏头痛靶点进行KEGG 通路富集分析（图4），结果显示，富集P值较显著的信号通路为氮代谢信号通路和脂质与动脉粥样硬化，富集靶点数量分别为8 个、12 个。这2 条信号通路富集的靶点基因数量为20 个，占天麻素抗偏头痛靶点数量的40.00%，可被认为是天麻素治疗偏头痛的关键分子通路。

图3 天麻素抗偏头痛靶点的GO生物过程富集分析条形图Note：Red refers to the biological process with more significant enrichment P-values.Fig.3 Bar chart of GO biological process enrichment of targets related to gastrodin against migraine

图4 天麻素抗偏头痛靶点的KEGG通路富集分析条形图Note：Red refers to the signaling pathway with more significant enrichment P-values.Fig.4 Bar chart of KEGG pathway enrichment of targets related to gastrodin against migraine

基于富集P值较显著的2 条信号通路，氮代谢信号通路富集的靶点基因为不同亚型的碳酸酐酶（CA），脂质与动脉粥样硬化信号通路富集的靶点基因主要包含如下3个方面。1）基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-9、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（CASP）1、CASP3、CASP8、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）等损伤、细胞凋亡相关靶基因；2）E - 选择素（SELE）、P - 选择素（SELP）等单核细胞激活相关靶基因；3）PI3K、糖原合酶激酶-3β（GSK3β）等细胞增殖过程相关靶基因。

通过Cytoscape软件将富集显著的20条KEGG 信号通路与30个靶点构建为靶点-通路网络（图5），结果显示，每条通路平均与6.15个靶点产生交互作用，每个靶点平均与3.84 条信号通路产生交互作用，体现了中药成分治疗疾病的多靶点、多途径效应，与中医学的整体观念不谋而合。

图5 天麻素抗偏头痛靶点-通路网络图Fig.5 Network of targets-pathway related to gastrodin against migraine

2.4 分子对接结果

将氮代谢、脂质与动脉粥样硬化等KEGG信号通路富集的20个靶点基因与PPI网络条形图中显示的30个靶点基因相对应，取重叠的14 个靶点基因与天麻素进行分子对接验证。以分子对接结合能的绝对值作为评价对接验证结果的指标，当分子对接结合能绝对值高于7 kcal/mol时，表明结合能力高。同时，采用临床治疗偏头痛的常见药物氟桂利嗪进行对照。结果天麻素与偏头痛相应靶点对接结合能绝对值均低于氟桂利嗪与偏头痛靶点对接结合能绝对值，天麻素与CA1，CA9，MMP - 9，CASP1 靶点的对接结合能绝对值高于7.5 kcal/mol。结果见表1。天麻素、氟桂利嗪与CA1 和CA9靶点的分子对接模拟图见图6。

图6 天麻素、氟桂利嗪与CA1和CA9的分子对接模拟图A.Docking of flunarizine with CA1 B.Docking of flunarizine with CA9 C.Docking of gastrodin with CA1 D.Docking of gastrodin with CA9Fig.6 Molecular docking simulation graph of gastrodin and fluranazine with CA1 and CA9

表1 天麻素、氟桂利嗪与相应偏头痛靶点基因的分子对接结果Tab.1 Molecular docking results of gastrodin，flunarizine and corresponding migraine targets-related genes

3 讨论

偏头痛是一种周期性反复发作、缠绵难愈的头痛疾病，疼痛发作时难以忍受，严重影响患者的日常生活。目前，其治疗以钙通道阻滞剂（氟桂利嗪或尼莫地平）为核心，联用天麻素的临床总有效率达90%以上［9-10］。天麻素通过多靶点、多途径治疗偏头痛。首先，天麻素及其衍生物通过抑制三叉神经激活，进而抑制三叉神经节及三叉神经脊束尾侧核血清降钙素基因相关肽的释放，降低一氧化氮（NO）、内皮素-1 等血管活性因子的表达水平，既可调节血管功能，也可通过降低血清肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1β、白细胞介素18等炎性因子水平而抑制神经源性炎性反应［11-17］。其次，天麻素通过降低氧化型低密度脂蛋白水平，改善偏头痛患者氧化应激水平，防止线粒体氧化应激损伤，减少凋亡小体的产生，从而下调细胞凋亡基因CASP 的表达［18］。最后，神经递质传递异常是偏头痛发生的主要机制之一，如5-羟色胺是偏头痛发作时神经功能异常的主要神经递质，天麻素通过升高血清5-羟色胺水平而改善神经功能紊乱［18］。

研究表明，偏头痛患者血清中MMP-9表达水平会明显升高［19-20］。CASP1涉及细胞凋亡过程，也可触发炎症［21-22］，为偏头痛神经源性炎症标志物。CA表达上调，可参与细胞迁移、CO2/NO 稳态与信号转导及偏头痛患者神经功能异常、神经源性炎症、血管功能异常等密切相关［14，23］。由图4可知，天麻素抗偏头痛靶点富集较显著的2条信号通路为氮代谢和脂质与动脉粥样硬化。由表1可知，上述信号通路直接相关的基因为CA1，CA9，CASP1，MMP-9等。分子对接结果显示，天麻素与上述基因的分子对接结合能绝对值均高于7.5 kcal/mol，对接良好，表明上述基因可成为天麻素抗偏头痛的主要靶点。

综上所述，天麻素可能通过调控氮代谢和脂质与动脉粥样硬化信号通路，影响CA，MMP，CASP 等靶点基因的表达，从而治疗偏头痛，但其具体作用机制有待后续实验证实。