免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测宫颈鳞状细胞癌组织中PD-1 和PD-L1 表达一致性研究

鲍书友，李丽，劳吉锋，倪建

宫颈鳞状细胞癌为女性常见的一种恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，且患病人群呈年轻化趋势，大部分患者预后不佳［1］。研究［2］指出，细胞的免疫应答与肿瘤的发生发展密切相关，特异性免疫检测的新靶点对改善宫颈鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤预后具有积极作用。临床研究［3］表明，激活程序性死亡分子1（PD-1）/程序性死亡分子1 配体（PD-L1）通路可促进宫颈癌、胃癌等恶性肿瘤细胞免疫逃逸，抑制机体产生免疫反应。大量研究［4-6］证实，抗PD-1/PD-L1 等免疫靶点治疗药物应用于肺癌、宫颈癌等中取得良好的抗肿瘤效果。目前存在多个商品化PD-1、PD-L1 免疫组化抗体，不同抗体使用的阈值、判读标准及检测平台均不同，因而也会有不同的治疗选择。本研究探究免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测宫颈鳞状细胞癌组织中PD-1 和PD-L1的表达水平与一致性，以期为临床检测宫颈鳞状细胞癌特异性免疫位点提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2019 年3 月至2021 年2 月被江阴市中医院病理科诊断为宫颈鳞状细胞癌的80 例患者石蜡组织标本，患者年龄25～86 岁［（65.17 ±7.63）岁］。纳入标准：（1）病理诊断为宫颈鳞状细胞癌［7］；（2）均未接受过放疗或化疗；（3）均接受PD-1抑制剂（纳武利尤单抗注射液）治疗；（4）年龄＞18 岁；（5）临床资料完整者。排除标准：（1）合并其他类型恶性肿瘤者；（2）阴道感染性病变者；（3）近1 个月内有免疫抑制剂服用史者；（4）妊娠期或哺乳期患者；（5）合并自身免疫疾病者。该研究已经医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫组化法 宫颈癌根治术标本取自宫颈鳞状细胞癌组织，采用石蜡包埋组织并切片（厚度为3 μm），脱蜡、脱水，随后实施抗原修复，加入过氧化氢阻断液（上海艾研生物科技有限公司），孵育15～20 min 后加入磷酸盐缓冲液（中国赛默飞世尔科技有限公司）洗涤3～4 次，3～5 min/次，再加入一抗PD-1（单克隆，克隆号MX033）与一抗PD-L1（单克隆，克隆号22C3），抗体均购自美国Abcam 公司，孵育过夜（4 ℃）。然后加入山羊抗兔二抗，采用含辣根过氧化酶标记（艾美捷科技有限公司），室温下孵育60 min，接着加入氨基联苯胺（上海机纯实业有限公司）孵育，用苏木精-伊红染色，切片后脱水，最后封片。在高倍镜下选择阳性细胞表达较多的区域视野，实施统计学处理。结果判读：PD-L1 主要在肿瘤间质免疫细胞或肿瘤细胞中表达，肿瘤间质免疫细胞PD-L1 阳性染色定位于细胞膜或细胞质，肿瘤细胞PD-L1 阳性染色定位于细胞膜（完全或部分膜染色）。PD-L1 阳性评分采用联合阳性评分法（CPS），CPS=［PD-L1 阳性细胞数（巨噬细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞）/活肿瘤细胞总数］×100，CPS≥1记为PD-L1 阳性。PD-1 主要在肿瘤间质免疫细胞与肿瘤细胞中表达，按照棕褐色、棕黄色、淡黄色、阳性着色分别记为3+、2+、1+、0，PD-1 阳性：着色3+与2+的细胞比例≥5%［8］。均由2 名经验丰富的病理科医师进行判定，如不一致协商决定。

1.2.2 RNAscope 原位杂交法 PD-1 与PD-L1 特异性探针均购自上海群己生物科技有限公司，采用荧光标记PD-1mRNA 与PD-L1mRNA。结果判读：PD-1mRNA 与PD-L1mRNA 阳性表现为细胞核或细胞质中有棕黄色点，呈棕黄色颗粒状。20 个点/细胞、16～19 个点/细胞、11～15 个点/细胞、1～10 个点/细胞、0 个点/细胞分别记为4 分、3 分、2 分、1 分、0 分，分值≥1 分记为细胞阳性［9］。均由2 名经验丰富的病理科医师进行判定，如不一致协商决定。

1.2.3 临床病理资料收集 收集整理有无淋巴结转移、有无神经侵犯、年龄、肿瘤分期（TNM）、肿瘤直径、有无脉管侵犯。

1.2.4 预后分析 患者从首次治疗结束后开始随访，随访1 年，记录PD-1mRNA 阳性表达与PD-1mRNA阴性表达及PD-L1mRNA 阳性表达与PD-L1mRNA阴性表达的总生存时间。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件分析所得数据，计数资料以百分比（%）表示，采用χ2检验；计量资料以±s表示，采用t检验。采用Kappa 一致性检验分析RNAscope 原位杂交法与免疫组化法检测结果的一致性，Kappa 值＜0.40 表示一致性差，0.40≤Kappa 值≤0.60 表示一致性一般，0.60＜Kappa 值≤0.08 表示一致性中等，Kappa 值＞0.80 表示一致性良好。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，二者生存曲线的差异比较行Log-rank 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测癌组织中PD-1 和PD-L1 表达一致性分析

免疫组化法结果显示，80 例宫颈鳞状细胞癌组织中PD-1 蛋白阳性52 例，阳性率为65.00%；PDL1 蛋白阳性60 例，阳性率为75.00%。RNAscope原位杂交法结果显示，80 例宫颈鳞状细胞癌组织中PD-1 蛋白阳性49 例，阳性率为61.25%；PD-L1 蛋白阳性57 例，阳性率为71.25%。免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测PD-1 表达一致性良好（Kappa=0.847，P=0.325）；免疫组化法与RNAscope原位杂交法检测PD-L1 表达一致性良好（Kappa 值=0.861，P=0.287）。见表1、2。

表1 免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测癌组织中PD-1 表达一致性分析（例，n=80）

2.2 RNAscope 原位杂交法检测癌组织中PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与其临床病理特征的关系

PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与患者年龄、脉管侵犯、淋巴结转移、神经侵犯、TNM 分期、肿瘤直径无关（P＞0.05）。见表3。

表2 免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测癌组织中PD-L1 表达一致性分析（例，n=80）

表3 RNAscope 原位杂交法检测癌组织中PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与其临床病理特征的关系（例，n=80）

2.3 PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与宫颈鳞状细胞癌患者预后的关系

随访1 年，80 例宫颈鳞状细胞癌患者失访2 例，随访率为97.50%。PD-1mRNA 阳性表达与PD-1mRNA 阴性表达的总生存曲线比较差异无统计学意义（χ2=0.037，P=0.847）；PD-L1mRNA 阳性表达与PD-L1mRNA 阴性表达的总生存曲线比较差异无统计学意义（χ2=0.255，P=0.636）。见图1、2。

图1 PD-1mRNA 阳性表达与PD-1mRNA 阴性表达的总生存曲线

图2 PD-L1mRNA 阳性表达与PD-L1mRNA 阴性表达的总生存曲线

3 讨论

有研究［10］指出，肿瘤微环境中的T 细胞浸润状态与宫颈癌的发生、发展与预后关系密切。目前，PD-L1、PD-1 等免疫位点已成为免疫治疗宫颈癌的重要靶点。相关研究［11］表明，PD-1 为细胞表面膜蛋白，能够结合肿瘤细胞配体PD-L1，减少机体T 细胞分化增殖，激活调节T 细胞活性，并可降低机体对肿瘤细胞的杀伤效应，而PD-1 抑制剂能够抑制PDL1、PD-1 的表达，以及能够抑制T 细胞耗竭，增加机体对肿瘤细胞的免疫杀伤能力，并可降低该通路对机体免疫系统的负向调控，从而改善肿瘤患者预后。有研究［12］表明，在宫颈癌细胞表面，PD-L1、PD-1 表达明显增加，其在宫颈癌的免疫逃逸中具有重要作用。故检测宫颈鳞状细胞癌组织中PD-L1、PD-1 表达对于临床开展免疫治疗具有一定的临床价值。

目前，临床上多采用免疫组化法测定PD-1 和PD-L1 表达情况，然而不同肿瘤细胞中PD-1 和PDL1 阳性表达不尽相同。因此，选择一种合适的评估方法测定免疫位点阳性率表达的一致性具有重要意义。研究［13］指出，RNAscope 原位杂交法是在原位杂交技术基础上检测特定基因mRNA 水平的检测技术，检测基因的mRNA 能够替代检测蛋白质。被检测基因的空间改变为诊断与预后提供了重要信息，尤其是在免疫肿瘤学中，免疫活性状态、细胞浸润、表型等可能与患者的生存时间密切相关。RNAscope 原位杂交法为一种全自动检测方法，可检测多个样本的RNA 水平，可定量检测特定RNA的表达，并能够避免主观性因素造成的误差，相较于免疫组化法，RNAscope 原位杂交法具有更高的灵敏度与特异度，但其成本较高［14］。

既往研究［15］结果显示，PD-1 和PD-L1 在宫颈癌组织中表达水平较高。本研究结果显示，免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测PD-1、PD-L1 表达一致性良好，考虑单纯采用免疫组化法测定PD-1、PD-L1 表达存在一定的偏差，因此采用RNAscope原位杂交法检测PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达水平。后续可采用免疫组化法联合RNAscope 原位杂交法检测免疫位点配体。已有研究［16］证实，RNAscope 原位杂交法适用于检测非小细胞肺癌组织中PD-1、PD-L1 表达，且与免疫组化法具有良好的一致性。本研究结果显示，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与患者年龄、脉管侵犯、淋巴结转移、神经侵犯、TNM 分期、肿瘤直径无关。有研究［17］指出，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与进展期胃癌患者肿瘤分化、性别、转移、年龄无关。国内有研究［18］表明，相较于PD-L1mRNA 阴性表达的胃癌患者，PDL1mRNA 阳性表达的患者总生存时间延长，而PD-1mRNA 表达与胃癌患者总生存时间无关。本研究进一步分析PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达对患者总生存时间的影响，结果显示，PD-1mRNA 阳性表达与PD-1mRNA 阴性表达的总生存曲线比较差异无统计学意义；PD-L1mRNA 阳性表达与PDL1mRNA 阴性表达的总生存曲线比较差异无统计学意义。提示PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与宫颈鳞状细胞癌患者总生存时间无关。

免疫组化法与RNAscope 原位杂交法检测宫颈鳞状细胞癌组织中PD-1 和PD-L1 表达一致性良好，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表达与患者总生存时间无关，后续可联合2 种检测方法检测宫颈鳞状细胞癌特异性免疫位点。