尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1的表达与HPV分型及复发相关

张朝晖, 李振守, 李慧芳, 胡小芳, 郭春辉, 姚润娟, 李俊晓

1.平煤神马医疗集团总医院,河南 平顶山 467000; 2. 郑州市妇幼保健院,河南 郑州 450000

尖锐湿疣是一种最常见的性传播疾病,也是一种发生在生殖道的良性肿瘤,由人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染引起[1]。尖锐湿疣患者病情进展通常较快、传染能力较强,尽管其治疗并不十分困难,但因复发率较高,常对患者身心健康造成严重影响[2]。尖锐湿疣的发生不仅与HPV感染有关,而且与免疫失衡、基因表达失调等有关,尖锐湿疣患者机体内的免疫系统受到严重抑制,尤其是细胞免疫功能低下使得HPV感染机体后在人体内大量且长期持续复制[3]。miR-34a-5p是一种具有抑癌基因作用的miRNA,在多种疾病中较正常组织低表达,且与HPV感染的宫颈癌密切相关[4]。JAG1是Notch信号通路中重要的配体,与受体结合后可激活相应信号通路,通过调节下游效应物影响细胞的病理和生理过程[5]。而Notch信号通路是一种与免疫炎症密切相关的信号通路,其异常激活与免疫疾病有重要联系[6]。因此,本研究分析miR-34a-5p、JAG1 mRNA在尖锐湿疣患者组织中的表达情况及其与预后、HPV分型的关系,以期为临床治疗提供思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年3月—2022年3月本院治疗的101例尖锐湿疣患者,其中男59例,女42例;年龄30～64岁,平均(43.79±10.15)岁;疣体位于生殖器40例、肛周29例、会阴18例、混合14例;病灶面积均为1～3 cm2。同期选取98例行包皮环切术或外阴整形术的患者作为对照组,其中男50例,女48例;年龄31～64岁,平均(44.19±10.28)岁;HPV阳性6例,均为低危型。两组性别(2=1.10,P=0.295)、年龄(t=0.28,P=0.783)比较,差异无统计学意义。

尖锐湿疣组纳入标准：①符合中华医学会皮肤性病学分会制定的《中国尖锐湿疣临床诊疗指南(2021完整版)》[7];②HPV阳性;③病历资料均齐全。对照组纳入标准：①术前行醋酸白试验筛查后未发现异常;②无配偶发病史或不洁性交史,无尖锐湿疣发病史及生殖器疱疹等;③病历资料均齐全。

两组排除标准：①哺乳期或妊娠期女性;②扁平疣、假性湿疣等其他疣患者;③4周内接受过物理或药物治疗者;④有其他病毒或病原菌感染、肿瘤、糖尿病等影响免疫系统疾病者。

本研究患者均由主治医师明确诊断,试验经研究对象本人同意及本院临床研究伦理委员会批准(批准号20190213)。

1.2 主要试剂及仪器

Trizol试剂(南京森贝伽生物科技有限公司);逆转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);HPV基因分型检测试剂盒(上海羽哚生物科技有限公司)。ABI 7500型实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)扩增仪(美国ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集 收集并记录尖锐湿疣患者疣体直径、病程、疣体数目等资料。

1.3.2 样品采集及保存 尖锐湿疣组收集患者治疗时留存的典型皮损组织,对照组收集女性行外阴整形手术切下的外阴组织或男性行包皮环切手术切下的正常包皮组织,将采集组织保存于无菌管中,置于-80 ℃超低温冰箱保存待测。

1.3.3 组织miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平检测 将组织研磨后采用Trizol试剂提取总RNA,检测其完整性及纯度后逆转录为cDNA,采用qRT-PCR方法检测miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平。引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。参数设置：95 ℃预变性1 min;95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。所有样品均重复3次,反应结束后采用2-ΔΔCT法计算miR-34a-5p、JAG1相对表达量,二者分别以U6、GAPDH作为内参基因。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.4 HPV基因分型检测 采用HPV基因分型检测试剂盒对6种低危型(包括HPV6、11、42、43、44、81)和15种高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)进行检测,按照试剂盒说明操作。

1.3.5 随访 尖锐湿疣患者采用微波联合外用药物治疗,治疗后定期复查,随访观察6个月,期间若出现醋酸白试验阳性亚临床感染病灶或出现新病灶,则属于尖锐湿疣复发。根据6个月后是否复发分为复发组和未复发组。

1.4 统计学分析

利用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析,计量资料均符合正态分布,以均值±标准差表示。尖锐湿疣组与对照组、不同HPV分型患者、不同预后患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平的比较行独立样本t检验或单因素方差分析,进一步组间比较行SNK-q检验;不同年龄、性别、疣体直径、病程、疣体数目患者中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平的比较采用t检验;采用Pearson法分析患者组织miR-34a-5p与JAG1 mRNA水平的相关性;采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平对尖锐湿疣患者复发的预测价值,采用Z检验比较AUC,以约登指数(灵敏度+特异性-1)的最大值为最佳截断值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尖锐湿疣组与对照组组织miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比较

qRT-PCR结果显示,尖锐湿疣组miR-34a-5p水平显著低于对照组,JAG1 mRNA水平显著高于对照组(P<0.05,图1,表2)。

图1 qRT-PCR检测 JAG1、miR-34a-5p的表达Figure 1 Expression of JAG1 and miR-34a-5p.

表2 尖锐湿疣组与对照组组织miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比较 (mean±SD)Table 2 Comparison of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels between condyloma acuminatum group and the controls (mean±SD)

2.2 尖锐湿疣患者组织miR-34a-5p与JAG1 mRNA水平的相关性

Pearson相关分析结果显示,尖锐湿疣患者组织miR-34a-5p与JAG1 mRNA水平呈负相关(r=-0.67,P<0.05,图2)。

图2 尖锐湿疣患者组织miR-34a-5p与JAG1 mRNA水平的相关性Figure 2 Correlation between miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels in condyloma acuminatum.

2.3 尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平与临床病理参数的关系

经比较发现,不同年龄、性别、病程、疣体数目的尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05);与疣体直径<10 mm患者比较,疣体直径≥10 mm的尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p水平显著降低,JAG1 mRNA水平增高(P<0.05,表3)。

表3 尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平与临床病理参数的关系 (mean±SD)Table 3 Relationship between miR-34a-5p, JAG1 mRNA levels and clinicopathological parameters in condyloma acuminatum (mean±SD)

2.4 不同HPV分型尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比较

经比较发现,与高危型和低危型患者比较,混合型尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p水平显著降低,JAG1 mRNA水平显著升高(P<0.05)。高危型尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p水平显著低于低危型患者,JAG1 mRNA水平显著高于低危型患者(P<0.05,表4)。

表4 不同HPV分型尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比较 (mean±SD)Table 4 Comparison of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels in condyloma acuminatum with different subtypes of HPV (mean±SD)

2.5 不同预后尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比较

治疗后6个月,32例复发,69例未复发。复发组miR-34a-5p水平显著低于未复发组,JAG1 mRNA水平显著高于未复发组(均P<0.05,表5)。

表5 不同预后尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比较 (mean±SD)Table 5 Comparison of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels in condyloma acuminatum with different prognosis (mean±SD)

2.6 miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平对尖锐湿疣患者复发的预测价值

以miR-34a-5p、JAG1 mRNA及二者联合(串联法)预测概率值为检验变量,将尖锐湿疣是否复发作为状态变量,绘制ROC曲线,结果显示,miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平及二者联合预测尖锐湿疣患者复发的AUC分别为0.767、0.821、0.891,二者联合预测AUC显著高于单独预测AUC(Z=3.44、1.94,P<0.05,图3、表6)。

图3 miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平预测尖锐湿疣患者复发的ROC曲线Figure 3 The ROC curve of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels for predicting recurrence of condyloma acuminatum.

表6 miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平对尖锐湿疣患者复发的预测价值Table 6 The predictive value of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels for the recurrence of condyloma acuminatum

3 讨论

尖锐湿疣的主要症状是疼痛、瘙痒、阴道分泌物增多和出血,但许多病例无症状[8-9]。尖锐湿疣主要通过性接触、母婴传播或日常间接感染等传播,其发生、发展、转归等均与机体免疫系统功能变化有关[10-11]。因此,探讨与免疫炎症相关因子的表达变化可能对改善尖锐湿疣治疗效果有重要作用。

miRNA可以通过与目标基因mRNA的互补配对在转录水平上调节基因,从而抑制mRNA的翻译或降解[12-13]。研究显示,miR-34a-5p表达与宫颈癌临床病理参数、HPV感染及生存结局有关[14-15]。Notch信号通路活性及受体和配体的表达与多种病理生理过程密切相关,其中JAG1激活Notch1信号通路在整个信号通路网络中发挥至关重要的作用[16]。JAG1与HPV之间存在复杂的协同作用[17]。miR-34a-5p可抑制细胞发育,并通过靶向HPV感染角质形成细胞中JAG1的表达来调节Notch1通路的活性[18]。

本研究结果显示,尖锐湿疣患者皮损组织中miR-34a-5p低表达、JAG1 mRNA高表达,在混合型和高危型HPV感染患者中miR-34a-5p低表达、JAG1 mRNA高表达,二者表达呈负相关,与孔玉龙等[19]研究结论部分一致。推测miR-34a-5p可能通过与基因JAG1靶向结合,负调控JAG1使其表达升高,进而影响Notch信号通路的信号传导,进一步参与尖锐湿疣病情进展。本研究推测与Gao等[18]研究结论基本一致,但其具体作用机制有待证实。

疣体直径≥10 mm的尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p水平较低、JAG1 mRNA水平较高,提示miR-34a-5p、JAG1 mRNA与尖锐湿疣的疾病进展有关,miR-34a-5p水平越低、JAG1 mRNA水平越高的患者,疣体直径可能越大。此外,尖锐湿疣复发患者中miR-34a-5p降低,JAG1 mRNA水平升高,且ROC曲线显示二者联合对尖锐湿疣复发有较高预测效能,当miR-34a-5p水平低于0.57,JAG1 mRNA水平高于2.03时,复发概率较高,提示临床可通过检测皮损组织中二者表达水平来辅助预测预后。

综上所述,本研究显示,尖锐湿疣患者组织中miR-34a-5p表达水平降低,JAG1 mRNA表达水平升高,且混合型HPV感染患者中miR-34a-5p水平低于高危型和低危型患者,JAG1 mRNA水平高于高危型和低危型患者。miR-34a-5p、JAG1 mRNA均与HPV分型有关,两者联合检测更有利于尖锐湿疣患者复发的预测。但本研究未能检测尖锐湿疣患者血清中miR-34a-5p、JAG1 mRNA表达情况,且研究样本量相对较少,后期需增大样本量、增加检测样本种类进一步探究二者的预测价值。