肠道微生物细胞外囊泡对心血管系统影响的研究进展

黄露霈 成泽东

(1.辽宁中医药大学研究生学院,辽宁 沈阳 110000; 2.辽宁中医药大学科技处,辽宁 沈阳 110000)

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)已成为世界范围内导致死亡和残疾的主要原因,而动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心肌梗死、卒中和不稳定型心绞痛等CVD的主要病理因素[1]。AS是一种慢性炎性动脉疾病,是大部分CVD的始动阶段,其发病机制尚不清楚,与炎症、氧化应激、免疫反应和感染密切相关[2],而肠道微生物区系作为炎症反应的刺激点之一,在AS和CVD的发生和发展中有重要作用,微生物来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)及其在细胞内和细胞间的沟通、携带物呈递和宿主免疫调节中的功能成为疾病机制研究的新热点。

目前在CVD中研究最多的是宿主细胞(内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)来源的EVs,与炎症、血管功能障碍密切相关[1]。而肠道来源的EVs携带多种蛋白、遗传物质、酶和代谢产物等,同样在CVD中起着不可忽视的作用。现主要对EVs的主要功能及其影响心血管系统的作用机制进行阐述,以期为CVD的诊断与治疗提供理论依据。

1 肠道微生物区系和AS

人体是一个超有机体,微生物通常与宿主为共生和互利的关系[3]。而肠道中的万亿细菌、病毒等构成肠道微生物区系,肠道微生物区系通过释放代谢产物,激活先天受体来影响宿主[3]。肠道微生物区系主要由两个细菌门组成,即拟杆菌门和厚壁菌门,占人类肠道菌群的90%以上。

近十年的研究证明了肠道微生物群与CVD之间的因果联系[4]。肠道菌群作为炎症的扳机点,脂质代谢和糖代谢的关键阶段,在心血管系统中的调节作用不容忽视。

2 肠道细菌来源的EVs的结构与功能

EVs是一种由原核生物、真核生物和古生物释放的双层膜结构囊泡状小体,直径为30～1 000 nm,拥有与亲本细胞相似的细胞膜[5],本质上是一种普遍的、可远距离运输的细胞间通信媒介[6]。

1965年Bishop等[7]首次发现了细菌的细胞外囊泡(bacteria extracellular vesicles,BEVs),它是由细菌释放的纳米级的脂质球形双层膜结构,大小为20～400 nm,密度为1.133～1.201 g/mL,携带了如肽、蛋白质(周质、细胞质、外膜蛋白等)、核酸、毒素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、磷脂、离子代谢物及信号分子等物质[8],可与宿主和其他细菌进行长距离的信息传递。不同种类的BEVs在结构、大小、密度和分子量组成上是不同的[9],而BEVs的功能与结构和其携带物有密切联系。革兰氏阴性菌产生的3种BEVs中,以外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)最为常见,大小为50～250 nm。革兰氏阳性菌主要通过内溶素触发的细胞死亡产生细胞质膜囊泡,它们通过脂磷壁酸与细胞质膜连接,依赖Toll样受体2激活免疫细胞[8]。

BEVs释放是普遍存在的,在多种肠道共生菌和病原菌中都能观察到,双向的细菌-宿主通信不涉及直接细胞接触,微生物和宿主来源的EVs都是这种域间串扰的关键因素[10],这是肠道微生物介导病原体-宿主相互作用的功能单元[11]。

BEVs是独立的0分泌系统(type 0 secretion system,T0SS)。分泌系统是通过细胞膜输出生物分子帮助细菌定植的工具,这些大分子结构能将蛋白质和DNA运送到细胞外或靶细胞中[12],具有以下作用：(1)致病作用;(2)协同作用;(3)拮抗作用。因此BEVs能改善细菌的适应性,并促进菌群之间以及宿主和微生物之间的相互作用,被称为T0SS。

BEVs是细菌的“防御工程”。BEVs是应激反应的体现,不同菌株的BEVs产生速率是不同的,当细菌受到外界因素(如温度、氧气、铁、抗生素等)刺激时会大量释放,BEVs是一种保护机制,它的产生量和速率与其生存能力正相关[9,13]。

BEVs是细菌的“远程武器”。BEVs携带的黏附分子可帮助细菌入侵宿主细胞[14];BEVs的微生物/病原体相关分子模式也可与宿主来源的宿主模式识别受体接触,引起宿主免疫耐受或免疫反应。此外,BEVs含有多种毒力因子,可抑制其他细菌生长、截获养分、损害其功能和防御能力以帮助亲本细菌成功定植生态位[14]。

3 肠道来源的EVs对心血管系统的作用

肠道屏障受损和内毒素血症是CVD发展过程中的关键介质,而如今微生物EVs到达体循环的途径主要是基于肠道渗漏理论。已有研究[15]证明BEVs可从肠道转移到不同哺乳动物的单个细胞中,而BEVs的转移不仅可在肠道上皮细胞内诱导短期效应,而且还通过靶向肠道干细胞而产生遗传变化。肠屏障破坏后,有毒物质(如BEVs)进入血液引起炎症,而这又进一步破坏肠道通透性[16-17],这会引起血清连蛋白(Zonulin)和含LPS的BEVs水平升高。在稳定状态下,少量BEVs仍可通过肠上皮的跨细胞作用逃逸到黏膜下通过血液传播[18]。

动脉硬化和炎症反应常贯穿CVD始终,而肠道菌群与二者有显著的相互作用关系。Ziganshina等[19]在AS斑块中发现了细菌的DNA,这些细菌主要来源于肠道,如金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌等。在肠道中,柯林斯菌属和乳酸杆菌属在AS患者中高表达,而罗氏菌属和拟杆菌属减少[4]。革兰氏阴性菌广泛存在于胃肠道中,细菌丰度的变化引起BEVs释放增加,BEVs的携带物质或许会激发机体慢性炎症,促进血管损伤和脂质摄取,已报道的BEVs影响动脉粥样硬化的相关机制见表1[20-31]。

3.1 幽门螺杆菌

幽门螺杆菌常定植于胃肠道,大部分存在于黏膜层,其OMVs通常被肠上皮细胞通过内吞作用摄取,目前无进入血液循环的证据[32]。幽门螺杆菌OMVs的细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated gene A,CagA)和LPS通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路促使内皮损伤,加速AS斑块的形成[33]。幽门螺杆菌EVs还可通过miR-25/KLF2轴调节NF-κB信号通路靶向调控人脐静脉内皮细胞,使人脐静脉内皮细胞内的NF-κB活性增强,血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1,ICAM-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1水平显著升高[20],引起血栓形成和血管炎症反应。此外,幽门螺杆菌感染通过宿主细胞外切体来损害患者和小鼠的内皮功能[21]。

表1 肠道微生物EVs对AS作用机制

3.2 拟杆菌

高胆固醇血症是CVD的主要致病因素之一,革兰氏阴性菌OMVs不仅能通过破坏肠道屏障来影响CVD患者脂质代谢,加速脂质堆积和AS斑块的形成。尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1 like 1,NPC1L1)位于小肠黏膜上皮细胞中,是肠道胆固醇转运入血的关键蛋白,脆弱拟杆菌和多形拟杆菌的OMVs通过提高NPC1L1水平,引起肠道胆固醇吸收增加,这与胆固醇运输、脂类稳态和胆固醇稳态密切相关[22]。此外,高水平的NPC1L1也与血管内皮功能障碍相关,增加动脉内中膜厚度、VCAM-1和ICAM-1的含量[23]。

3.3 嗜黏蛋白阿克曼菌

嗜黏蛋白阿克曼菌是一种黏蛋白降解菌,是人类肠道微生物中含量最丰富的单一物种之一,近年关于其对肥胖的机制研究[24]较多,肥胖是CVD的危险因素之一,可导致血脂异常及胰岛素抵抗。嗜黏蛋白阿克曼菌与其EVs作用相近,其EVs并未直接影响AS的症状或临床指标,而是通过增加紧密连接蛋白的表达,改善由高脂血症引起的肠道屏障通透性,显著减少高脂小鼠体重和脂肪重量,明显降低血糖、胆固醇水平和代谢性炎症反应以此间接地改善心血管系统[25]。此外,普拉梭菌和嗜黏蛋白阿克曼菌EVs均能使过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)激活,以降低血脂水平和炎症反应,提高斑块的稳定性[26]。

3.4 大肠杆菌

大肠杆菌是人类肠道中的机会致病菌,在CVD患者体内该菌种数量显著增加,且在人类AS斑块中发现了来自大肠杆菌的LPS[34]。一项研究[27]表明,大肠杆菌OMVs可诱导心肌细胞出现不规则钙振荡,血液中肌钙蛋白显著增加,心壁厚度增加,心率加快;此外OMVs还能引起血管钙化,能提高促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α、IL-6等的表达,促进CVD发生和发展,损伤心肌细胞和心功能。来自尿路致病性大肠杆菌、铜绿假单胞菌和淋球菌的OMVs能诱导依赖B细胞淋巴瘤因子-2家族成员促凋亡蛋白(BCL2 antagonist/killer,BAK)途径和非依赖BAK途径的线粒体凋亡,使巨噬细胞激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体介导的免疫反应[28],NLRP3炎症小体是驱动血管炎症反应的关键因素。虽然目前无大肠杆菌、铜绿假单胞菌和淋球菌OMVs通过线粒体凋亡影响心血管系统的直接证据,但线粒体凋亡与AS、心肌梗死和心房颤动等CVD关系密切,在CVD发病机制研究方面有重大潜力。

3.5 古菌

古菌病毒也是肠道微生物区系中的重要组成部分,经检测共有56个古菌种存在于肠道,其中以产甲烷古菌属最为丰富[35],古菌的存在与AS的加重呈正相关[36]。Moreno等[29]在重症急性心肌梗死患者血清中检测到大量具有高负电荷的古菌微泡(microvesicles,MVs)。古菌MVs数量与AS严重程度成正比,而在重症患者的不稳定斑块中,肺炎支原体和古菌的共生会加剧外周血中这两种病原体MVs的释放,引起血清基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)水平显著升高,MMP9引起的氧化应激与斑块破裂和血栓形成密切相关。

3.6 牙龈卟啉单胞菌

牙龈卟啉单胞菌属于口腔菌群,但CVD与口腔菌群间的联系已得到证实,同时口腔菌群与肠道菌群存在相互作用,口腔细菌仍可定植于肠道[37]。牙龈假单胞菌及其OMVs可聚集血小板促使AS血栓形成[38],牙龈卟啉单胞菌OMVs还能直接损伤血管内皮细胞,还可引起血管平滑肌细胞钙化[30-31]。此外,其OMVs能通过裂解血小板内皮细胞黏附分子-1来破坏血管内皮通透性,这有助于免疫细胞通过内皮向动脉内膜迁移来诱导血管炎症[31]。

4 肠道来源的BEVs在CVD中的临床价值

4.1 药物载体与治疗靶点

EVs具有独特的低免疫原性、高稳定性及高特异性等特点,在CVD的治疗中有较大应用潜力[39-40]。天然的或生物改造过的BEVs同样可作为药物载体,利用其表面的配体-受体识别、基因和表面修饰与宿主细胞靶向结合[13],将药物精确地输送到细胞内,起到特异性、高效的治疗作用。天然的BEVs在生物修饰后一定程度上能增强其稳定性、生物活性以及呈递、细胞内转运和靶向结合能力[41]。如产酶溶杆菌C3的外膜OMVs可将抗生素输送到靶真菌生物体[42]。此外,由于BEVs高特异性靶向结合能力使其能成为治疗靶点。Roufaiel等[43]提出,用LPS刺激模式识别受体后,可在主动脉内皮细胞表面检测到CD11c+活化蛋白C,能有效清除内膜中的衣原体而不会引起局部炎症反应。Xia等[21]证明中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869抑制外切体分泌,可有效保护幽门螺杆菌感染小鼠的内皮功能。

4.2 疫苗制备

由于BEVs外膜成分能诱导免疫反应,且具有低免疫原性和稳定性,因此还可制备疫苗来防治CVD,或许将健康人群肠道BEVs注射到患者体内将成为一种新方式[44]。目前已有将OMVs疫苗运用到脑膜炎、淋病、肿瘤等疾病的研究报道[45-46]。近年来有不少关于用细菌来源的疫苗治疗AS的报道,如肺炎链球菌、牙龈卟啉单胞菌等[47-48],用牙龈卟啉单胞菌从鼻腔进行接种,显著减少了ApoE-/-小鼠的AS斑块大小,治疗效果可达到他汀类药物组水平;间隔6个月接受2次13价肺炎链球菌多糖疫苗接种,可使患者抗氧化低密度脂蛋白IgG和IgM抗体显著增加,有效缓解因氧化低密度脂蛋白导致的免疫反应。而OMVs能更有效地诱导体液免疫反应,OMVs疫苗不仅能作为异种抗原载体,还具有跨属保护的潜力[49]。但BEVs来源的疫苗也有局限性,OMVs能引起严重毒性反应[46];由于目前技术的缺陷,BEVs产量低,不足以形成规模;易被其他细胞蛋白质污染;去污剂可能破坏其膜成分会影响其特异性或呈递功能;BEVs在不同产生途径下所携带的物质不同,激发的免疫反应是不同的,如何进行BEVs筛选和剂量确定也是亟待解决的问题。

5 展望

目前肠道菌群与CVD的相关研究还局限于有限数量的病原体-宿主之间的相互作用,胃肠道细菌EVs对CVD、AS、心肌梗死等作用机制研究仍处于初级阶段。由于革兰氏阳性菌的研究相对缺乏,本文主要聚焦于革兰氏阴性菌EVs对CVD的影响,但革兰氏阳性菌EVs又会对CVD加重或缓解产生什么作用,不同来源、种类和产生途径的BEVs如何参与CVD的发生和发展,在不同的CVD中是否存在共同的致病BEVs,目前相关的研究与信息相对较少,这将给基于肠道菌群探讨CVD的发病机制和治疗方案提供不一样的视角。