HBV BCP/PC 突变对发生肝癌危险的系统评价

符 微，黄圣楷，孙 龙

（海南医学院第一附属医院感染性疾病科，海南 海口 570102）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的重要公共卫生问题［1］，呈世界性流行，全球约有2.57 亿慢性HBV 感染者，全球每年约有88.7万人死于HBV 感染相关疾病，是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB），肝硬化（liver cirrhosis，LC）和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的主要病因［2］。肝癌是全世界第六大癌症，在癌症致死率中位居第三［3］。尽管目前对HBV 所致的肝炎及肝硬化有很好的疗效，进行抗乙肝病毒治疗能够阻止疾病继续发展，甚至可以有很好的转归，但是肝癌在世界上发病率和死亡率仍然很高，因此肝癌的预后非常差，对肝癌的预防、预测及诊断是一个公共的卫生问题及挑战。

乙型肝炎病毒HBV 是环状脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），因其逆转录酶（reverse transcriptase，RT）不具有校对或编辑活性，在进行逆转录过程中会出现许多基因突变，本荟萃分析主要针对研究HBV 基因基本核心启动子（basal core promoter，BCP）-A1762T/G1764A 和前核心区（precore，PC）-G1896A 的突变［4-6］。这两种基因突变随着病程进展发生，阻止乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）的产生［7］，使机体自身免疫防御功能受限，另而可促进乙肝病毒的脱氧核糖核酸（hepatitis B virus - deoxyribonucleic acid ，HBV-DNA）大量复制，导致肝功能恶性循环的损害，加重肝病病情，使肝癌发生风险增加。另外HBV 一共有八种基因型，其中B 基因型和C 基因型在亚洲普遍存在，许多研究表明，HBV 感染的肝病进展与基因型有密切关系，而且不同的基因型对临床症状表现及预后均不同［8，9］。

在以往许多报道中显示，慢性HBV 感染的临床过程可能会被几种特定的病毒突变所改变，这种突变在HBV 患者仍存在争议。因此进行了系统的荟萃分析，研究在HBV BCP/PC 产生基因突变时对肝脏疾病进程的影响，对肝癌的发生发展风险评估，对肝癌的预测及防治得到有用的信息。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

1.1.1 研究类型 病例对照研究。

1.1.2 研究对象 纳入HBV 感染的的患者，并根据以下分组：HCC 和CHBC、CHB、LC，对于CHBC、CHB、LC 及HCC 的诊断根据《慢性乙型肝炎防治指南（2019 版）》；以及HBV B 基因型及C 基因型分组。

1.1.3 结局指标 关注各HBV 感染分组中BCP-A1762T/G1764A 以 及PC-G1896A 的 突 变情况。

1.1.4 排除标准 （1）合并有肝外相关疾病包括系统性红斑狼疮、风湿类疾病、肾功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病、肿瘤类疾病、糖尿病等；（2）排除合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎、代谢性肝病、自身免疫性肝病、胆汁淤积性肝病、药物性肝损害、遗传代谢性肝病以及转移性肝脏肿瘤者等相关肝脏疾病。

1.2 文献检索策略

计算机检索PubMed、SCI、CNKI、VIP 和 Wan-Fang Data 数据，收集突变在HBV 感染相关疾病进程中作用的文献，检索时限均为建库至2021 年7 月1 日。此外，追溯纳入文献的参考文献，以补充获取相关文献。检索采取主题词和自由词相结合的方式，中文检索词乙肝病毒、突变、基础核心启动子、前核心区、肝细胞癌等；英文检索词包括：hepatitis B virus、HBV、mutation、mutations、mutant、hepatocellular carcinoma、liver cancer、hepatoma 等。

1.3 文献筛选与资料提取

两人首先独立选择研究，最后整理归纳时出现意见分歧进行讨论。如果两人在相互讨论后还没得到同意结果时，由第三人判定并给予决策。如果遇到同一作者相关文章中的研究时间及研究群体重叠率超过30%，综合考量后选用研究时间最新或者纳入群体最大文章。两位研究员对纳入的40 篇文章进行阅读全文，收集其作者、出版日期、研究国家、发生肝癌数、纳入病例总数、HBV 基因型、BCP-A1762T/G1764A 以 及PC-G1896A 突 变 情 况。对所纳入文章质量的评估对照Wei 等［10］方法，使用改良纽卡斯尔-渥太华量表（NOS）用于评价研究质量。改进后的NOS 是基于9 个项目的10 分评分系统。分数越高，学习质量越高。

1.4 纳入研究的偏倚风险评价

采用漏斗图评价发表偏倚。

1.5 统计分析

使用优势比（OR）和相应的95%置信区间（CI）进行数据评估。纳入研究结果间的异质性检验水准为α=0.1，同时结合I2定量判断异质性大小。若各研究结果间无统计学异质性，则采用固定效应模型进行Meta 分析；若各研究结果间存在统计学异质性，则进一步分析异质性来源，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型进行Meta 分析。Review Manager 软件版本5.4 用于数据分析。所有统计测试都是双尾，P＜0.05 的差异被认为是统计学意义。

2 结果

2.1 文献筛选流程及结果

确定了2 170 篇潜在的相关文章，去除每个数据库中重复文章836 篇，对余1 334 篇研究进行初步标题及摘要筛选，排除1 247 篇（例如基础研究、合并丙型肝炎感染、病例报道、会议文章等情况）。其余87 篇文章进行全文阅读，确定有肝癌及病例对照组的40 篇文章最终纳入本文荟萃分析（表1），总共病例数为12 423 例，肝癌数为3 710 例（图1）。

表1 纳入研究的基本特征Tab 1 Basic characteristics of included studies

图1 Meta 分析中文章筛选的流程图Fig 1 Flowchart for article screening in the meta-analysis

2.2 结果

2.2.1 BCP-A1762T/G1764A 与 PC-G1896A 在CHBC、CHB、LC、HCC 的 突 变 分 析 在 比 较BCP-A1762T/G1764A 在HBV 感染疾病进程中突变情况时［11-48］，先在HCC 与non-HCC 间比较，发现异质性是明显的，所以在此使用了随机效应模型。根据数据显示突变在HCC 与non-HCC 对比中，由此可见突变增加了肝癌发生的风险。在HCC 与CHBC 比较时（OR=3.90，95%CI=2.13～7.17，P＜0.000 1），与CHB 比 较 时（OR=2.77，95%CI=1.78～4.32，P＜0.000 01），与LC 比 较 时（OR=1.64，95%CI=0.95-2.84，P=0.005），结 合 以 上 对HBV 感染发生的CHBC、CHB、LC 与HCC 进行亚组分析，根据统计学结果显示三组均P＜0.05，差异有统计学意义，说明BCP-A1762T/G1764A 基因突变与HBV 感染的疾病进程相关，逐渐累及促进肝癌的发生。见图2。

图2 HCC 与non-HCC、CHBC、CHB、LC 的BCP-A1762T/G1764A 基因突变分析Fig 2 Mutation analysis of BCP-A1762T/G1764A gene in HCC and non-HCC，CHBC，CHB，and LC

在比较PC-G1896A 突变在HBV 感染疾病进程关 系 时［11，13，15，17，19，21-23，25-29，31，32，34-38，43，45-49］，发 现HCC与non-HCC 有异质性，在统计学上使用随机效应模型。PC-G1896A 突变在HCC 与non-HCC 对比中，差异有统计学意义，PC-G1896A 突变对肝癌的产生有影响意义。同时进行亚组分析，在比较HCC 与LC 分组的时候，所得出P=0.4，差异没有统计学意义，分别在HCC 组中为122/240，LC 组中为80/193，不排除为样本量的影响，需要在更大样本量中再次进行统计学分析。对于CHBC、CHB 亚组中，与HCC 比较时PC-G1896A 突变，差异均有统计学意义。图3。

图3 HCC 与non-HCC、CHBC、CHB、LC 的PC-G1896A 基因突变分析Fig 3 Mutation analysis of PC-G1896A gene in HCC and non-HCC，CHBC，CHB，and LC

2.2.2 BCP-A1762T/G1764A 以及PC-G1896A 在B 基因型、C 基因型的突变分析 通过分析BCP-A1762T/G1764A 突变在B 基因型与C 基因型的 关 系［12，16，19，24，27，35，39，40，50］，根 据 所 得 出 的 数 据 表，异质性是显著的。在两组基因型中，C 基因型在突变更为显著。但是在本荟萃分析中关于在HCC 分组中研究BCP-A1762T/G1764A 突变情况中差异没有统计学意义，与Ito 以及Liu 等［27，45］研究结果不一致，有待于进一步收集更多数据再观察。见图4。

图4 B 基因型、C 基因型的BCP-A1762T/G1764A 基因突变分析Fig 4 Mutation analysis of BCP-A1762T/G1764A in genotype B and C

研究B 基因型、C 基因型在PC-G1896A 突变中［27，35，40，45，50］，所 得 的 结 果 显 示 差 异 没 有 统 计 学 意义。见图5。

图5 B 基因型、C 基因型的PC-G1896A 基因突变分析Fig 5 Mutation analysis of PC-G1896A in genotype B and C

最后分析在C 基因型中，HCC 与non-HCC 中BCP-A1762T/G1764A/PC突变的意义时［11-14，24，31，39，49］，发现两者均有明显的异质性，由此可得出在C 基因型中，BCP-A1762T/G1764A 以及PC-G1896A 基因突变对增加肝癌的发生有着明显的影响。见图6。

图6 C 基因型中BCP-A1762T/G1764A 与PC-G1896A 基因突变分析Fig 6 Mutation analysis of BCP-A1762T/G1764A and PC-G1896A genes in genotype C

2.3 敏感性分析

分别依次对最高突变数量以及最低突变数量的文章进行剔除，所得结果与最终结果差异不大，所以不给予剔除。

2.4 偏倚风险评价结果

粗略对漏斗图进行观察（图7、8）。

图7 BCP-A1762T/G1764A 基因突变的漏斗图Fig 7 Funnel plot of the BCP-A1762T/G1764A gene mutation

3 讨论

对于肝癌的发生，有证据表明与特殊性BCP/PC 基因变异和HBV 表达的基因型相关。因此这些在HBV 感染中可能是一些目前未发现的生物学标志，对此研究可对HCC 的早期发现和预防提供有效的信息。

图8 PC-G1896A 基因突变的漏斗图Fig 8 Funnel plot of the PC-G1896A gene mutation

乙型肝炎病毒HBV 是一个环状部分双链DNA病毒，也是一种包膜病毒，其生物学功能是通过核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）中间物使用其自身编码的RT 进行复制［51-53］，但是由于其HBV RT 不具有校对或编辑活性，伴随着每天大量的病毒粒子生成，复制过程中不可避免地会出现错误，导致出现大量突变基因，加速肝脏疾病进程，触发肝癌发生。在正常运作的DNA 校对机制下发生的突变，如果对生物体不利，则会被纠正或自然选择出来，从而维持基因组并产生保守序列。BCP 是调控PC和HBV 前基因组RNA 转录，主要的突变位点的是A1762T、G1764A。BCP 突变时可能通过去除受体结合基因序列而增加基因组前RNA 的转录，从而增加病毒DNA 的复制能力，同时创造干细胞抗因子结合受体的结合位点，导致前核心信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid ，mRNA）发生抑制和前基因组核糖核酸（pregenomic ribonucleic acid ，pgRNA）转录的增强，因此病毒复制的总体增强［54，55］。一般来说，核心启动子BCP 区域的突变通常会导致可能导致恶性肿瘤的基因下调或上调，可能是触发HCC 发生的机制。在该meta 分析中，主要研究BCP-A1762T/G1764A 在HBV 感染疾病进程中的关系，结果表明突变中HCC 与non-HCC、CHBC、CBC、LC 的OR 值为4.05、3.90、2.77、1.64，与大多数研究结果一致，表明突变可促进HBV 感染疾病进展，对HCC 发生有重大作用。PC 是编码HBeAg 的起始区域，主要的突变位点指G1896A。PC 突变时产生终止密码子，阻止PC 蛋白的翻译，消除HBeAg 的产生，因此可产生HBV 病毒逃逸，促使这些患者持续合成高水平的HBV-DNA［56，57］。血清HBeAg，既是HBV 感染的诊断指标之一，也参与机体免疫调节。因此，PC 基因的突变不仅可影响甚至误导HBV 感染的诊断，也为HBV 持续性感染提供有利条件，导致肝病的持续进展。比较HCC 与non-HCC 在PC-G1896A 基因突变的关系时，其异质性是显著的，差异有统计学意义，突变对肝癌的产生有影响意义，也同样证实了突变对肝病发展有促进作用。这两种基因突变随着病程进展发生，使肝癌发生风险增加。

又因为不同的HBV 基因型与肝脏疾病进展、抗病毒疗效、患者预后关系密切，与A 型或D 型HBV 比 较，B 型、C 型 基 因 的HBeAg 血 清 学 转 换 率低、转换时间晚，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的清除率低，肝组织病变严重，肝硬化或HCC 的发生率高，对干扰素治疗的应答率低，基因突变率更高［58-60］。我国HBV 以B 型、C型基因为主，C 型基因更为常见，疗效不佳，基因突变可能是主要原因之一［61，62］。在研究HBV 的B、C基因型与BCP/PC 突变之间的关系时，发现PC-G1896A 突变与基因型的差异没有统计学意义，与大多研究表明的这个突变可促进HBV 疾病进程，继发HCC 的产生结果不一致，这可能是本研究所选取的在突变上B、C 基因型样本量小，需要在更大样本上进行再次评估。

本研究的局限性：（1）本研究只收集B、C 基因型，应完善其他HBV 感染基因型与基因突变的关系，为HCC 的发病机制提供更有效的解读。（2）纳入研究质量参差不齐，部分研究存在选择性偏移、实施偏移及测量性偏移。受样本量及研究设计局限性影响，本荟萃分析结果尚需大样本、多中心、高质量的研究予以证实。

此荟萃分析结果显示，在HBV 感染的肝脏疾病中，BCP-A1762T/G1764A 以及PC-G1896A 突变对疾病发展过程具有明显生物学效应，这些突变使发生肝癌的风险独立预测因素之一，并且HBV 基因型可以增加患有HCC 的风险。

所有作者声明无任何利益冲突关系。