人参根际土壤微生物群落结构与土壤环境因子的关系

赵雪淞，王力恒，骆世洪，杨晨曦，朱家佳，高 欣，陈洪磊

（1.辽宁工程技术大学环境科学与工程学院，辽宁阜新 123000；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110161；3.东北师范大学生命科学学院，长春 130024）

人参是名贵中药材，具有重要的药用价值和经济效益。由于野山参被过度挖掘，已难觅踪迹。人参栽培在我国有着悠久历史，但人参忌连作，忌地性强，对土质及生长环境条件要求严格，老参地土壤继续种植人参会引发严重的土传病害，导致减产甚至绝收。人参连作障碍严重制约人参产业的可持续发展。传统微生物检测方法和现代分子生物学技术研究均表明，人参连作后引起的土壤生态环境的改变有利于人参病原菌的生长，不利于土壤中有益微生物的生长，土壤微生物群落结构失衡[1-6]。

在土壤中，植物根系通过分泌各种化学物质对根际微生物的种类、数量和分布产生影响，而根际微生物通过不同的响应机制对根系分泌物释放、土壤物质循环、能量流动、信息传递等产生重要影响，从而影响植物的生长发育和健康状况[7-9]。NICOL 等[10-11]研究发现，西洋参（Panax quinquefolius）能在生长过程中通过根系向环境中释放人参皂苷，而人参皂苷能够促进西洋参锈腐病病原菌毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）和根疫病病原菌畸雌腐霉（Pythium irregulare）的生长，抑制包括生防菌哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）在内的非病原菌的生长。后续研究发现，畸雌腐霉能产生降解人参皂苷的糖苷水解酶，水解二醇型人参皂苷产生低极性的水解产物人参皂苷F2[12]。IVANOV 等[13]研究发现，人参皂苷具有化学趋化作用，能够吸引西洋参病原菌畸雌腐霉（P.irregulare）在富含人参皂苷的根际聚集并加速生长。WANG 等[14-15]研究了人参（Panax ginseng）根中的人参皂苷各级分及其单体与土壤真菌的互作关系，发现总人参皂苷、二醇型人参皂苷、人参皂苷单体Rb1、Rb2能够促进人参病原菌毁灭柱孢菌（C.destructans）生长，而毁灭柱孢菌能够产生胞外糖苷酶水解二醇型人参皂苷，该酶对人参皂苷的专一性与畸雌腐霉分泌的糖苷酶相似。此外，几种非人参病原菌的土壤真菌也能够降解人参皂苷，降解路径与毁灭柱孢菌相似。上述研究表明，人参皂苷进入根际土壤之后可能会增加人参病原真菌的丰度，改变微生物群落结构，人参皂苷与土壤微生物群落的互作可能是导致土壤微生物区系失衡、发生连作障碍的关键因子。人参皂苷与人参根际土壤微生物在群落水平上的互作关系值得深入研究。

磷脂脂肪酸（PLFA）是活体微生物细胞膜的主要成分，不同区域不同类型土壤中的微生物可以通过不同的生理生化途径合成不同的PLFA。它对环境因素敏感，能够敏锐地反应土壤微生物群落对土壤无机环境变化的响应，因此被用作“生物标签”来分析土壤菌群微生物量和结构变化[16-17]。本研究利用PLFA技术研究不同种植年限的人参根际土壤微生物群落结构及多样性变化，采用UPLC-MS/MS 方法测定土壤中8 种人参皂苷单体的含量，化学方法测定土壤化学性质并计算综合肥力指数（IFI）的变化，分析人参根际土壤微生物群落与土壤环境因子的关系，为老参地土壤生态修复以及人参连作障碍的破解提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验区位于吉林省白山市抚松县泉阳镇人参地（E127°01'～128°06'，N41°42'～42°49'），气候类型为大陆性高山气候，冬季寒冷漫长积雪深，夏季温热短暂雨量集中。年均降水量763～834 mm，年平均气温为4 ℃，年平均日照2352.5 h，日照率为53%，无霜期130 d，土壤类型为黑钙土。

1.2 土样采集

人参按照当地习惯进行种植[1-2]。种植人参之前，农田被森林土覆盖。人参种植2年后移栽至新样地（新样地仍然是被森林土覆盖的农田），再继续种植2，3，4年，土壤样品采集于2020年9月，种植年限分别为4（2+2）、5（2+3）和6（2+4）年的人参根际土壤（以下称G4、G5 和G6），以未种植过人参的森林土（以下称G0，是新样地G4的森林土）作为对照。参床长20 m，宽1.5 m，高0.3 m。从每个参床中随机选择10 株健康人参连根挖起，通过刷根收集附着在人参根上的根际土壤，并汇集在一起作为1个样本，每个处理采集3个参床，共采集12个样本，记录采集地点、采集时间及生长年限，用自封袋装封土样并编号，用冰袋运回实验室，并分为两个子样品。一个子样品晒干后通过2 mm 筛用于土壤化学性质和人参皂苷含量分析；另一个子样品液氮冷冻后保存在-80 ℃下用于检测PLFA。采样点各年生人参田间管理措施一致。

1.3 测定项目及方法

参考鲁如坤[18]的方法测定土壤化学性质；土壤pH值测定用酸度计法；有机质测定用水合热重铬酸钾氧化-比色法；全氮测定用开氏消煮法；碱解氮测定用碱解扩散法；全磷测定用酸溶-钼锑抗比色法；有效磷测定用碳酸氢钠法；全钾测定用氢氧化钠熔融法；速效钾测定用乙酸铵提取法。

人参皂苷含量测定：取1.2节采集的土壤样本，每个样本称取1 g，加入甲醇超声波提取2次，合并提取上清液旋蒸浓缩，然后加入色谱级甲醇，过滤定容至1 mL后利用UPLC-MS/MS（仪器为岛津8050）的MRM 模式进行定量分析。液相条件：流动相A和B分别是酸水（0.1%甲酸）和乙腈；柱箱温度为35 ℃；色谱柱是C18柱（Shimpack GIST C18，2 μm，100×2.1 mm），流速为0.2 mL·min-1，进样量10 μL。采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱条件为0～12 min，5%～95% B；12～13 min，95% B。MS 分析条件：采用负离子模式，通过MRM 模式对化合物进行检测，接口温度300 ℃，DL 温度250 ℃，加热块温度450 ℃，干燥气流量15 L·min-1，加热气流量5 L·min-1。每个样本3个重复。

磷脂脂肪酸（PLFA）分析：参考TOMOHIRO等[19]的方法优化步骤，称取6 g鲜土进行磷脂脂肪酸提取纯化及甲酯化，以十九烷酸甲酯（19:0，10 mg·mL-1）为内标，利用气相色谱仪GC-2010（岛津）、HP-5 MS 色谱柱（Agilent，30 m×0.25 mm×0.25 μm）测定样品脂肪酸含量，载气为氮气，以37种脂肪酸甲酯混标(FAME 37，47885-U;Supelco)和26种混合细菌酸甲酯（47080-U）为外源标准定性，内标法定量，测定结果用nmol·g-1表示。

PLFA 的命名参照FROSTEGARD 等[20-22]的方法。细菌（Bacteria，B）生物量通过10:0，11:0，10:0 2-OH，12:0，14:1，14:0，i15:0，a15:0，15:0，14:0 2-OH，14:0 3-OH，i16:0，16:1，16:0，i17:0，17:0，18:0，19:0和20:0脂肪酸含量进行计算，其中，革兰氏阳性细菌（Gram-positive bacteria，GP）以14:0，i15:0，a15:0，15:0，i16:0，i17:0来计算，革兰氏阴性细菌（Gram-negative bacteria，GN）通过10:0 2-OH，14:1，14:0 2-OH，14:0 3-OH，16:1，16:0 进行计算。真菌（Fungi，F）生物量用18:2ω9,12，18:1ω9c，18:1ω9t计算。

1.4 土壤综合肥力指数（soil integrated fertility index，IFI）计算

用土壤有机质、pH 值、土壤全氮和碱解氮、土壤全磷和速效磷、土壤全钾和速效钾作为分肥力指标计算分肥力系数（IFIi），然后利用修正的内梅罗公式[23]来计算土壤综合肥力指数（IFI）。土壤各属性分级标准值参考第二次全国土壤普查标准（表1）。

表1 土壤各属性分级标准值Table 1 The grading standards of soil properties

1.5 土壤微生物群落多样性指数的计算

以PLFA 含量为依据计算微生物多样性指数，丰富度指数(R)/S 表征物种数，Shannon-Wiener 多样性指数(H')表征群落中的物种丰富度，H'与Simpson指数(D)共同反映微生物alpha多样性，Pielou均匀度指数(J)是基于H'来计算物种多样性，反映各微生物数目分配的均匀程度，计算公式参考王文铜[24]的研究。

1.6 数据处理

利用Excel 2013 软件进行数据计算，利用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），用F 统计量进行多因素方差分析，采用最小显著差异法（LSD）进行差异显著性比较，利用Origin 2019b 绘图，利用Canoco 5.0 进行冗余分析（RDA）。

2 结果与分析

2.1 土壤PLFA含量和类型的变化

由表2 可知，不同样本检测出的PLFA 含量和类型各不相同，在G0、G4、G5、G6 土壤样本中分别鉴定出22，18，18，18 种PLFA，G0 中a15:0 含量最高，而G4、G5、G6 中19:0 含量最高。12:0 2-OH，14:0 2-OH，17:0，16:0 2-OH 为G0 特有脂肪酸，人参根际土壤中未检出；12:0 3-OH 是G6 特有脂肪酸，G0、G4、G5 中未检出；11:0 是G0、G4、G5共有脂肪酸，G6中未检出；磷脂脂肪酸12:0 2-OH，14:0，i15:0，a15:0，14:0 2-OH，16:0，i16:0，16:1ω9c，i17:0，17:0，16:0 2-OH，18:0（表征细菌）在G0 中的含量显著高于人参根际土壤，而18:2ω9,12，18:1ω9c，18:1ω9t（表征真菌）在G0 中的含量显著低于人参根际土壤（p＜0.05）。上述结果说明，人参栽培导致人参根际土壤微生物群落组成发生明显变化，栽培年限亦有影响。

表2 土壤PLFA含量和类型Table 2 Content and type of soil PLFA

2.2 土壤微生物群落结构的变化

不同类型的土壤微生物在环境中有不同生态位，土壤微生物各类群PLFAs 含量的变化及其比值可以表征微生物群落结构的变化[25]。由图1可知，人参根际土壤G4、G5、G6的总PLFAs含量和细菌PLFAs含量均显著低于G0（p＜0.05），而真菌PLFAs含量与G0相比逐渐上升，G6的真菌PLFAs含量显著高于其他样本（p＜0.05）；G4、G5、G6之间总PLFAs含量、G+细菌PLFAs含量和G-细菌PLFAs含量无显著差异。

图1 土壤微生物类群PLFA含量及比值Figure 1 PLFA content and ratio of soil microbial groups

上述结果说明种植人参降低了根际土壤微生物群落总丰度和细菌群落丰度。而增加了真菌群落丰度；在本研究范围内人参生长年限对其根际土壤微生物群落总丰度影响不显著。真菌/细菌（F/B）比值由G0 的0.07上升到G6的0.65，二者差异显著，说明长期种植人参使其根际土壤真菌比例增加、其根际土壤微生物群落结构明显改变。各土壤样本间G+菌/G-菌（GP/GN）比值未表现出显著性差异，说明土壤细菌群落结构没有显著改变。

2.3 土壤微生物群落多样性的变化

土壤微生物群落多样性反映了土壤微生物群落的生态特性，代表了微生物群落的稳定性。利用PLFA 类型和含量计算土壤微生物群落多样性指数，以此说明土壤微生物群落多样性的变化。由表3可知，与G0相比，G4、G5、G6 丰富度指数下降，多样性指数亦有所下降，G4 达显著水平，反映出人参根际土壤微生物群落丰度和稳定性降低。与G0相比，G4、G5、G6均匀度指数和优势度指数虽有波动，但未达显著性差异。

表3 土壤微生物群落多样性指数Table 3 Diversity index of soil microbial community

2.4 土壤人参皂苷含量的变化

人参根中皂苷占根干重的3%～7%，目前已从人参根中发现了至少37种天然的人参皂苷单体[26]。人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1和Re 是人参根总皂苷的主要成分，含量占总皂苷的90%以上，其中Rb1含量最高，不含有G-VXII和F2[26-27]。前期研究发现，Rb1显著促进人参根部病原菌生长，而人参病原菌能够降解Rb1，降解路径为Rb1→G-XVII/Rd→F2[14]。据此，本研究采用UPLC-MS/MS 方法对土壤样本中的人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Re 以及G-VXII 和F2进行定量分析，结果表明（表4），G0 中8 种人参皂苷单体的含量极低或者未检出，而3种人参根际土壤样本中8种人参皂苷单体均有检出，其中Rd含量均最高；与G4相比，G5和G6中二醇型人参皂苷Rb1、Rb2和Rc 的相对含量以及三醇型人参皂苷Rg1和Re 的相对含量均下降，而G-VXII 和F2的相对含量增加。以上结果表明，人参在生长过程中向土壤中分泌人参皂苷，除Rd 外人参根分泌的人参皂苷在土壤中的相对含量随栽培年限的增加而降低，而人参皂苷Rb1的降解产物—人参皂苷G-VXII和F2的相对含量随着栽培年限的增加而增加。前述土壤微生物群落组成结构及多样性分析表明，人参根际土壤中真菌群落的相对丰度增加，这会增加人参根际土壤中人参皂苷的降解，致使降解产物Rd、G-VXII和F2的相对含量增加。

表4 土壤中人参皂苷含量Table 4 The content and ratio of ginsenosides in soils

2.5 土壤化学性质和综合肥力指数的变化

由表5可知，与G0相比，人参根际土壤pH值、有机质、全氮、全磷、速效磷含量均显著下降（p＜0.05），其中全氮和全磷含量下降尤其显著，说明人参种植导致土壤中植物生长发育必需的营养物质减少，土壤酸化。由图2可知，4个土壤样本综合肥力指数（IFI）的范围在0.85～1.69之间，各样本IFI值表现为G0＞G4＞G6＞G5，差异显著（p＜0.05）。

图2 土壤综合肥力指数Figure 2 Soil integrated fertility index

表5 土壤化学性质Table 5 Chemical properties of soil

2.6 土壤微生物群落与土壤环境因子的关系

2.6.1 土壤PLFAs含量与化学性质的冗余分析 土壤微生物各类群PLFAs 含量及比值与化学性质共15 个指标变量的冗余分析结果如图3。前两个排序轴共解释了总体变异的85.88%。G0 位于RDA2 轴的上侧，与RDA2 正相关；而G4、G5、G6（除了一个G6 平行样本）位于RDA2 轴的下侧，与RDA2 负相关；二组之间有明显的空间分异，说明与未种植过人参的森林土相比，人参根际土壤微生物群落结构和化学性质发生明显变化，而3 种人参根际土壤具有相似的微生物群落结构和化学性质。根据RDA 排序图，土壤PLFAs 总量及土壤微生物各类群PLFAs 含量与土壤有机质、速效磷、全氮、pH值、全磷含量正相关，说明土壤细菌群落丰度和真菌群落丰度均与土壤肥力状况正相关；土壤微生物各类

图3 土壤微生物各类群PLFA含量与化学性质的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis of PLFA content of soil microbial groups and chemical properties

群PLFA含量与OM 的夹角最小，与TN和AP的夹角次之，说明与土壤有机质含量的相关性最高，其次是全氮和速效磷。上述结果说明土壤微生物群落丰度的降低与土壤营养物质的减少密切相关。

2.6.2 土壤PLFAs含量与人参皂苷含量的冗余分析 土壤微生物各类群PLFAs含量和人参皂苷含量共14个指标变量的冗余分析结果如图4。在RDA1 轴上，土壤PLFAs 总量及土壤细菌PLFAs 含量位于RDA1 轴左侧，与排序轴负相关，而土壤真菌PLFAs含量、8种人参皂苷单体含量以及8种人参皂苷总量位于RDA1轴右侧，与排序轴正相关，其中人参皂苷F2与RDA1轴的夹角最小，说明与主成分1的相关性最高。在RDA2轴上，土壤真菌PLFAs 含量与人参皂苷F2位于轴的上半侧，与排序轴正相关，而土壤PLFAs 总量、土壤细菌PLFAs 含量及其它人参皂苷位于RDA2 轴下半侧，与排序轴负相关，其中土壤真菌PLFAs 含量与RDA2 轴的夹角最小，说明与主成分2的相关性最高。土壤真菌PLFAs含量与人参皂苷Rd、G-VXII和F2的夹角小于90°，说明这3种人参皂苷与土壤真菌丰度的相关性高。土壤细菌PLFAs含量和PFLAs总量与8种人参皂苷的夹角均大于90°，表明存在负相关关系。

图4 土壤微生物各类群PLFA含量与人参皂苷含量的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis of PLFA content of soil microbial groups and ginsenoside content

3 讨论与结论

微生物群落特性是正确揭示土壤生态系统水平的关键要素。土壤微生物群落结构组成和活力可以被不同种类微生物特征磷脂脂肪酸（PLFA）含量及组成变化评价[28-29]。本研究中，磷脂脂肪酸12:0 2-OH，14:0 2-OH，17:0，16:0 2-OH 在未种植过人参的森林土G0 中出现，而在人参根际土壤中消失，说明人参栽培导致其根际土壤微生物群落丰度下降、土壤微生物群落组成和多样性发生明显变化，而这几种消失的PLFA 代表的土壤微生物可能是人参连作障碍的标志微生物。4～6 年生人参根际土壤微生物PLFAs 总量和细菌PLFAs 含量与G0相比均显著降低，真菌PLFAs含量却逐年增加，与G0 相比G6 的F/B 值显著升高，说明长期种植人参导致其根际土壤微生物群落结构发生明显变化。XIAO 等[4]利用PCR-DGGE 方法对栽参土壤微生物群落进行分析，结果表明栽参土壤微生物群落组成变化显著，人参种植年龄的增加导致细菌多样性减少和真菌多样性增加。LI 等[3]采用随机扩增多态性DNA 分析技术研究了连作人参土壤微生物多样性，结果表明土壤栽参后引起的生态环境的改变不利于细菌和放线菌的生长，有利于真菌的生长。张亚玉[30]分析了不同种植年限的农田栽参根区土壤PLFA 含量的变化，研究结果与本研究相似。真菌数量增多会增加真菌病害发生的可能性，是土壤环境劣变的标志。

植物根系分泌物直接参与植物和土壤环境的交流，在调控根际微生态系统结构与功能方面发挥着重要作用[31]。本研究首次系统测定了人参根际土壤中8种人参皂苷单体的含量，结果表明人参根际土壤G4、G5、G6中Rd含量均最高，人参根系分泌到土壤中的人参皂苷Rb1、Rb2、Rc以及Rg1和Re的相对含量随着栽培年龄的增加而降低，同时人参皂苷降解产物Rd、G-VXII和F2的相对含量增加。土壤微生物各类群PLFAs含量与人参皂苷的冗余分析表明，土壤真菌群落丰度与人参皂苷Rd、G-VXII和F2显著正相关，而土壤细菌群落丰度与8种人参皂苷均负相关，说明人参皂苷单体Rd、G-VXII和F2含量的变化是导致人参根际土壤微生物群落结构变化的关键环境因子。土壤微生物群落结构的变化会导致土壤代谢能力、病害拮抗能力和生物降解的变化[2]。上述结果与前人的报告[14-15]相联系，说明人参皂苷单体Rb1、Rb2被分泌进入根际土壤之后吸引并促进病原真菌的生长繁殖，引起真菌群落的相对丰度增大。人参种植年限越长，真菌群落的相对丰度越高；而增多的土壤真菌产生更多的人参皂苷降解酶，致使人参皂苷Rb1、Rb2等加速降解为Rd、G-VXII 和F2等低极性产物。随着人参栽培年限的增加，人参皂苷降解产物Rd、G-VXII和F2的相对含量增加，同时真菌群落丰度增加，二者呈强相关。土壤中的Rd 有2 个来源：由人参根分泌到土壤中以及由土壤微生物降解Rb1产生，这可能是人参根际土壤中Rd含量最高的原因。调整老参地土壤微生物群落结构是恢复土壤健康的可行思路。

土壤营养物质耗竭是形成植物连作障碍的重要因素。窦森等[32]研究表明，随栽参年限的增加，土壤有机质、全氮等物质含量以及pH 值下降。左湘熙[33]对农田人参根际土壤细菌群落与土壤理化指标的冗余分析表明，土壤pH 值、速效磷、速效钾对土壤细菌群落的影响较大。丛微等[34]研究了林地人参3 年和4 年后土壤细菌群落结构与土壤理化指标的相互关系，发现土壤pH 值和速效钾、全钾含量是影响土壤细菌群落结构的重要因素。与上述报道相似，本研究中与G0 相比，人参根际土壤IFI 值显著下降，pH 值显著降低，有机质、氮、磷等营养物质含量显著减少；冗余分析表明人参栽培是影响土壤微生物群落结构和化学性质的重要因素，土壤微生物群落丰度的降低与土壤营养物质的减少密切相关。

综上所述，与对照森林土壤相比，人参根际土壤微生物群落的组成和结构发生了显著变化，土壤细菌群落丰度显著下降，真菌群落丰度增加，人参根际土壤肥力显著下降。人参在生长过程中不断向根际土壤中分泌人参皂苷，除Rd 外随着种植年限增加人参根系分泌的5 种主要的人参皂苷单体在土壤中的相对含量下降，人参皂苷降解产物G-VXII 和F2相对含量升高。人参皂苷Rd、G-VXII 和F2与土壤真菌丰度显著正相关，而土壤有机质、全氮、全磷、速效磷和pH 值与土壤微生物各类群丰度均正相关。土壤人参皂苷单体Rd、G-VXII 和F2含量的变化是导致人参根际土壤微生物群落结构劣变的关键环境因子。土壤pH 值和有机质、全氮、全磷和速效磷含量显著下降是导致土壤微生物群落丰度下降的关键环境因素。调整土壤微生物群落结构和营养状况是老参地土壤生态修复的可行办法。