大蒜素对感染性休克大鼠脑的保护作用

刘建东,陈清云,于峰伟,孙争宇

1.驻马店市中医院康复科,驻马店 463000;2.河南省人民医院神经内科,郑州 450000

感染性休克为临床常见危重症之一,又被称为内毒素/脓毒性休克,病理特征包括低血压、低血氧症、代谢性酸中毒、全身性炎症反应等[1]。感染性休克发病后可累及多个脏器,导致肝肾功能减退、心功能不全、肺水肿等改变,且可造成脑组织缺氧、缺血,影响中枢神经系统,引发脑损伤[2]。其中,脑内促炎因子与抗炎因子平衡失调是感染性休克导致脑损伤的一个重要环节[3]。因此,加强感染性休克患者早期干预、减轻炎性反应、促进神经元修复、保护脑组织功能,已逐渐成为重症医学科研究的重点之一。大蒜素是一种常见的二烯丙基三硫化物,具有多种药理作用,如抗炎、抗氧化、抗凋亡等[4]。既往研究发现[5],大蒜素能对小胶质细胞的活化进行抑制,控制脑缺血再灌注大鼠炎性反应,减轻脑损伤,但就其对感染性休克患者脑损伤保护作用及机制的研究仍较少。本研究开展动物实验,分析大蒜素对感染性休克大鼠脑损伤的保护作用,并探讨其机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BX51-P型光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社);ELx800型全自动酶标仪(美国BioTek公司);GelDoc型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 试药

大蒜素注射液(黑龙江迪龙制药有限公司);磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路抑制剂LY294002[凯梅根(上海)生物科技有限公司];肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-8,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)酶联免疫吸附法试剂盒均购自上海晶抗生物工程有限公司;TdT介导的dUTP缺口末端标记(TdT mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL)染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司);苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色试剂盒(北京索来宝科技有限公司);二奎啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)蛋白试剂盒(湖北武汉富鑫远科技有限公司);兔抗大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR一抗及山羊抗兔IgG二抗均购自德国罗氏诊断有限公司。

1.3 动物

选取60只健康SD雄性大鼠,7周龄,体质量260～280 g,购自北京天诚医药科技有限公司,许可证号:SYXK(京)2016-0047。适应性喂养3 d,温度(22±2) ℃,湿度55%～60%,12 h光照,自由饮水,普通饲料喂养。本研究动物处置符合“3R”标准,经动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 模型制备与分组

60只大鼠中随机取10只作为正常组,剩余50只建立感染性休克大鼠模型[6]。建模方法:大鼠用戊巴比妥钠50 mg·kg-1(2.5 mL·g-1)腹腔注射麻醉,仰卧位固定在手术台上。取右腹股沟正中切口,逐层分离皮肤、皮下组织,游离右股动脉,近心端以动脉夹夹闭,留置针穿刺股动脉,松开动脉夹,观察出现血液回流,即为穿刺成功,随后经尾静脉注入内毒素(5 mg·kg-1溶于5 mL生理盐水)。建模成功标准:内毒素注入后2 h平均动脉压<5.3 kPa(1 kPa=75 mmHg),且维持2～3 h以上,同时出现少尿、皮肤发绀、躁动不安等表现。50只大鼠建模成功42只,成功率为84.00%。将42只大鼠随机分为模型组(10只)、大蒜素组(10只)、抑制剂组(11只)、抑制剂+大蒜素组(11只)。正常组大鼠术中仅穿刺,不注入内毒素,其余步骤同上,10只大鼠均纳入研究。

2.2 动物干预

建模成功后立即开始治疗。大蒜素使用前用生理盐水配制成质量浓度为5 mg·mL-1的溶液。大蒜素组大鼠按照10 mL·kg-1体质量,以质量浓度5 mg·mL-1大蒜素溶液腹腔注射;抑制剂组大鼠按照10 mL·kg-1体质量,以质量浓度5 mg·mL-1LY294002腹腔注射;抑制剂+大蒜素组大鼠按照10 mL·kg-1体质量,以质量浓度5 mg·mL-1LY294002+质量浓度5 mg·mL-1大蒜素混合液腹腔注射,正常组和模型组大鼠以10 mL·kg-1体质量生理盐水腹腔注射,均为单次给药。

2.3 神经功能评估

各组治疗后24 h,以神经功能缺陷评分(Neurological Severity Scores,NSS)评估神经功能损伤情况[7]:0分,神经功能无明显异常,活动正常;1分,瘫痪侧前肢不能充分伸展;2分,活动时不自觉向瘫痪侧旋转;3分,活动时不自觉向瘫痪侧倾倒;4分,意识丧失。

2.4 取材与处理

完成神经功能评估后,以戊巴比妥钠50 mg·kg-1(2.5 mL·g-1)腹腔注射麻醉,断头处死,取脑,轻柔剥取双侧脑海马组织,分为4份。2份置于液氮中保存,2份置于质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛中固定。

2.5 炎性指标检测

采用酶联免疫吸附法检测。取1份保存于液氮中的脑海马组织,用生理盐水反复冲洗,冰浴下制备组织匀浆。4 ℃以12 000 r·min-1离心10 min,离心半径8 cm,取上清液。严格按照TNF-α、IL-6、IL-1β试剂盒说明书操作,记录450 nm处的吸光度值,分别以吸光度值、对照品浓度作为纵坐标、横坐标,绘制标准曲线,根据标本吸光度值计算指标浓度。

2.6 脑海马神经元凋亡检测

采用TUNEL荧光染色法检测脑海马神经元凋亡情况。取1份用质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛固定的脑海马组织,常规石蜡包埋,切片厚4 μm。严格按照TUNEL染色试剂盒说明书操作,显微镜400倍视野下随机选择4个视野。TUNEL染色凋亡细胞呈绿色荧光,计算神经元凋亡率。神经细胞凋亡率=(凋亡细胞数量/总细胞数量)×100%。

2.7 海马CA1区组织病理形态学检测

采用HE染色法检测海马CA1区组织病理形态学。取1份用质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛固定的脑海马组织,用生理盐水冲洗,磷酸缓冲液浸泡10 h。脱水,石蜡包埋,切片厚4 μm,用烤片机烤干。二甲苯透明,梯度乙醇脱蜡,流水冲洗。苏木精染色5 min,盐酸乙醇分化,流水冲洗30 min。伊红染色3 min,流水冲洗。梯度乙醇脱蜡,二甲苯透明,中性树胶封片。于显微镜下观察大鼠海马CA1区组织病理形态学。

2.8 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量检测

采用蛋白质印迹法检测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的相对表达量。取1份保存于液氮中的脑海马组织,用磷酸缓冲液清洗2次,加RIPA裂解液反应30 min。4 ℃以12 000 r·min-1离心10 min,离心半径8 cm,取上清液。用BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量检测,加入2×上样缓冲液,沸水浴变性10 min。用质量浓度为100 g·L-1的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,分离蛋白,转膜,加质量浓度为50 g·L-1的脱脂奶粉封闭1 h。加兔抗大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin(1∶1 000)一抗,室温下孵育2 h。TBST洗膜4次,每次10 min。加ECL增强化学发光试剂,Image Quant LAS4000生物分子成像仪显影曝光。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 神经功能比较

各组大鼠NSS组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠的NSS升高;与模型组比较,大蒜素组大鼠的NSS降低,而抑制剂组的NSS升高;与大蒜素组比较,抑制剂+大蒜素组的NSS升高;与抑制剂组比较,抑制剂+大蒜素组大鼠的NSS降低。结果见表1。

表1 各组NSS的比较

3.2 TNF-α、IL-6、IL-1β含量比较

TNF-α、IL-6、IL-1β水平组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,模型组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量升高;与模型组比较,大蒜素组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量降低,而抑制剂组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量升高;与大蒜素组比较,抑制剂+大蒜素组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量升高;与抑制剂组比较,抑制剂+大蒜素组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量降低。结果见表2。

表2 各组TNF-α、IL-6、IL-1β含量的比较

3.3 神经元凋亡情况比较

神经元凋亡率组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,模型组神经元凋亡率升高;与模型组比较,大蒜素组神经元凋亡率降低,而抑制剂组神经元凋亡率升高;与大蒜素组比较,抑制剂+大蒜素组神经元凋亡率升高;与抑制剂组比较,抑制剂+大蒜素组神经元凋亡率降低。结果见图1、表3。

注:A.正常组;B.模型组;C.大蒜素组;D.抑制剂组;E.抑制剂+大蒜素组。

表3 各组大鼠脑海马神经元凋亡率的比较

正常组脑组织结构及细胞层次清晰,神经元排列整齐,细胞质丰富,核仁清楚;模型组和抑制剂组脑组织细胞明显肿胀,神经细胞排列稀疏,神经元排列较紊乱,可见空泡神经元,其中抑制剂组的异常改变更明显;大蒜素组和抑制剂+大蒜素组脑组织结构、神经元排列、神经细胞形态等的异常改变减轻,其中大蒜素组的改善更显著。结果见图2。

注:A.正常组;B.模型组;C.大蒜素组;D.抑制剂组;E.抑制剂+大蒜素组。

3.5 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量比较

各组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,模型组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相对表达量降低(P<0.05);与模型组比较,大蒜素组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相对表达量升高,而抑制剂组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相对表达量降低;与大蒜素组比较,抑制剂+大蒜素组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相对表达量降低;与抑制剂组比较,抑制剂+大蒜素组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相对表达量升高。结果见图3、表4。

表4 各组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量的比较

图3 各组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表达水平

4 讨论

感染性休克主要是由微生物及其毒素等所致的脓毒病综合征伴休克,病死率较高[8]。感染性休克发生后可致使大量炎性因子分泌,引起血流分布改变,导致动脉血压下降、灌注不足,造成多脏器损伤[9]。其中,脑组织因自身氧储备量小,成为感染性休克最易累及的器官之一,特别是脑组织海马CA1区最为敏感[10]。既往临床多采用西药治疗,虽在中枢神经系统保护方面有一定作用,但不良反应也较多,治疗安全性不高[11]。中医认为,感染性休克属于“厥证”“脱证”范畴,病因有内外之分,内因包括毒瘀痰热内生,外因包括六淫毒邪、疫病之气,主要病机为正气不足、气阴俱亏、气机逆乱、脏真受损、阳脱阴竭,治疗当以清热解毒、益气养阴、活血化瘀为主[12]。大蒜为常用中草药之一,可清热解毒、活血化瘀、温中行滞,其有效成分大蒜素具有多种生物学功能,包括抗炎、抗氧化、抗菌、保护心血管系统、抑制血小板聚集等[13]。有文献报道[14],大蒜素可改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经功能评分,减轻炎症反应及脑水肿,抑制神经元凋亡。还有研究发现[15],大蒜素对阿尔茨海默病大鼠的神经元有一定保护作用,可抑制病情进展。

研究表明,脑损伤后,神经胶质细胞可分泌大量IL-6浸润脑实质,而TNF-α启动炎症级联反应,使炎症因子不断生成、分泌,槲皮素通过抑制炎症反应导致的脑组织神经细胞凋亡,降低NSS,起到脑保护作用[16]。

大蒜素是否能降低由炎症反应引起的细胞凋亡,从而改善感染性休克大鼠脑损伤仍需进一步探讨。本研究的结果显示,应用大蒜素后大鼠NSS,TNF-α、IL-6、IL-1β含量,神经元凋亡率降低,HE染色显示海马CA1区脑组织结构、神经元排列、神经细胞形态等异常改变减轻,表明大蒜素可减轻感染性休克大鼠的炎性反应及脑组织损伤,抑制神经元凋亡。张昆[17]也发现,大蒜素可改善感染性休克大鼠海马CA1区病变及细胞凋亡,与本研究共同证实大蒜素对感染性休克脑损伤具有抑制作用。

PI3K/Akt通路在多种生理过程的信号转导中具有调节作用,例如细胞增殖、凋亡、分化,同时在炎症、代谢及肿瘤疾病中同样发挥调控作用。韩睿等[18]研究发现,血必净注射液对缺血性脑损伤大鼠有一定神经保护作用,可减轻炎性反应,其作用可能与调控PI3K/Akt信号通路有关。还有学者提出[19],PI3K/Akt通路激活对由脓毒症所致的脑损伤有抑制作用,能减轻神经炎症、氧化应激反应,抑制神经元凋亡。王亿龙等[20]提出,放射性脑损伤中,PI3K/Akt/mTOR通路参与神经细胞存活、凋亡过程,激活该通路可缓解炎性反应,减轻神经细胞凋亡。骨痹汤通过调节该信号通路降低血清中TNF-α和IL-1β的含量,改善骨关节炎大鼠病理症状[21]。以上研究提示,PI3K/Akt通路引起的炎症反应与感染性休克大鼠脑损伤可能存在密切关系。本研究的结果显示,用大蒜素治疗后大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相对表达量升高,且PI3K/Akt通路抑制剂可减弱大蒜素的治疗作用,表明大蒜素可激活PI3K/Akt通路,这可能是大蒜素改善感染性休克大鼠脑损伤的作用机制之一。

综上所述,大蒜素可减轻感染性休克大鼠的炎性反应、抑制神经元凋亡,发挥脑损伤抑制作用,机制可能与激活PI3K/Akt通路有关。本研究的不足之处在于仅就大蒜素经PI3K/Akt通路的作用进行分析,未对这一通路中的多个靶标进行分子水平的探讨,且未就其他途径进行探讨,而大蒜素对感染性休克脑损伤的抑制作用是经多途径实现的,故今后仍需进一步研究。