中江白芍加工前后不同部位的重金属分析与风险评估
2023-05-07王晓晓
李 曦,马 越,王晓晓
1.四川省药品检验研究院(四川省医疗器械检测中心),成都 611730;2.四川科伦药物研究院有限公司,成都 611138;3.绵阳市食品药品检验所,绵阳 621000
白芍为毛茛科芍药PaeonialactiforcPall.的干燥根的加工品。作为大宗药材,白芍在经典名方四物汤、逍遥散和芍药甘草汤中均有应用,2020年版《中国药典》(简称药典)中含有白芍的中成药达189种,如四物颗粒、根痛平颗粒和麻仁丸等。德阳市中江县作为白芍的道地产区之一,种植历史悠久,面积广泛。芍药在种植过程中随着化肥和农药的使用会引入重金属,植物从污染环境中吸取养分的同时,也会对重金属进行富集,造成中药中重金属含量超标,从而影响药材的安全性。药典中仅对白芍进行了重金属限量的规定[1]。重金属元素不是人体必需元素,通常对人体有害,服用被污染的中药材会使重金属进入体内不能被肝脏分解代谢而积存在大脑、肾脏等人体重要器官,超出人体的调节限度就会对人体正常代谢产生明显毒性,损伤人体正常机能,导致健康问题[2-4]。对中江白芍中重金属的分析和健康风险评估可从源头明确中江白芍的安全性情况,并指导中江白芍的综合利用和产业的可持续发展。本研究以四川中江种植芍药根(SY)及其须根(XG)与经加工后的白芍(BS)和栓皮(SP)等不同部位及根际土壤(TR)作为研究对象,测定以铅(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、铜(Cu)和镉(Cd)为代表的重金属元素,研究白芍加工前后不同部位的安全性并进行重金属健康风险评估,为白芍的安全性质量控制以及临床安全用药奠定基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 7900电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司);百万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);KQ-700DV超声清洗仪(昆山市仪器超声有限公司);MARS 6微波消解仪(美国CEM公司);EHD-24电热消解仪(北京东航科技仪器有限公司)。
1.2 试药
100 μg·mL-1多元素对照品溶液(Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Ti、V、Zn)来源于国家有色金属及电子材料分析测试中心。Bi、Ge、In、Li、Sc和Tb的混合内标溶液(Agilent公司,10 μg·mL-1),氢氟酸、磷酸、高氯酸为分析纯、硝酸为离子级(成都市科隆化学品有限公司);超纯水(ULPHW-111-10T型,四川优普超纯科技有限公司)。35份芍药样品及根际土壤均从四川中江县采集,见表1,经德阳市食品药品安全检验检测中心李茂森主任中药师鉴定为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的根。35份新鲜芍药根采收后,除去芽头,置于清水中除去泥沙,晾干后,放入烘箱中,60 ℃烘干,即得白芍加工前的样品芍药根(编号1～37对应样品SY1～SY37,共35份)。收集芍药根剪下的细根,干燥后即得加工前的须根(编号1～37对应须根XG1～XG37,共32份样品,无XG4、XG11、XG19、XG25、XG26)。收集须根周围的泥土即得根际土壤样品(编号1～37对应土壤编号TR1～TR37,无TR19、TR20)35份。新鲜芍药根先用沸水煮透心,竹刀刮去外皮,55 ℃烘干,即得加工后的白芍样品(编号1～37对应白芍编号BS1～BS37,共35份样品,无BS19、BS20)[5]。另外,收集白芍加工过程中刮下的栓皮,置于烘箱中55 ℃烘干,得到加工后栓皮样品(编号1～37对应栓皮SP1～SP37,共35份样品,无SP19、SP20)。不同部位样品及土壤见图1。
表1 芍药样品来源
注:A. 白芍;B. 芍药;C.栓皮;D. 须根;E. 土壤。
2 方法
2.1 重金属对照品溶液的制备
用多元素混合标准母液以体积分数为5%的优级纯HNO3为介质配制成含Pb、Cd、As、Cu均为0、20、50、100、200、500 ng·mL-16个质量浓度梯度的混合对照品溶液,同时制备空白溶液。Hg以体积分数为5%的优级纯HNO3为介质配制成质量浓度分别为0、0.5、2、5、10、20 ng·mL-1的Hg对照品溶液,同时制备空白溶液。溶液均过0.45 μm的微孔滤膜。
2.2 内标溶液的制备
精密量取混合内标液适量,用水稀释制成200 ng·mL-1的混合对照品溶液,即得。
2.3 ICP-MS的测定条件
等离子射频功率1 550 W,等离子气体流量15 L·min-1,辅助气体流量1.03 L·min-1,雾化气流量1.03 L·min-1,补偿/稀释气体1 L·min-1,雾化室温度2 ℃,蠕动泵速度0.1 rps。采样深度8.0 mm,积分时间1 s,延迟时间1 s,重复次数3次;测量方式为标准曲线法;读数方式为峰强。以73Ge、115In、209Bi为内标,能有效克服仪器信号的漂移和校正基体效应。
2.4 供试品溶液的制备
2.4.1植物样品的重金属元素供试品溶液的制备 白芍取样品粉末0.2 g(过5号筛),精密称定,于聚四氟乙烯消解罐中,置于通风橱,加入浓硝酸8 mL,放置过夜。第2天放入微波消解仪中,按设定的消解程序处理:先经10 min由室温升至130 ℃,并维持5 min消解,然后10 min由130 ℃升至165 ℃,并维持10 min消解,然后15 min由165 ℃升至180 ℃,并维持40 min消解。消解完毕后,冷却至室温,取出消解罐,在通风橱中将消解罐中液体挥发至2～3 mL,转移,用去离子水定容至50 mL。同步以硝酸8 mL做空白实验。
2.4.2土壤样品重金属元素供试品溶液的制备 精密称取土壤样品0.10 g(过6号筛),置于聚四氟乙烯消解罐内,精密加入HNO3和HClO4体积比1∶1混合酸液5 mL,再精密加入HF 5 mL。放置过夜,按照2.4.1项下方法消解。不加土壤样品作试剂空白对照。将消解好的样品用超纯水冲洗转移至50 mL量瓶内定容。经0.45 μm微孔滤膜滤过后上机测定。
2.4.3标准曲线的制备 取多元素的混合对照品母液,依次测定各元素的系列质量浓度对照溶液,内标进样管始终插入内标溶液。以对照品质量浓度为横坐标(x)、重金属元素分析峰信号值与内标元素参比峰响应值的比值为纵坐标(y),绘制标准曲线,得各重金属元素对照品的回归方程、相关系数和线性范围。结果Pb、Cd、As、Cu元素在20～500 ng·mL-1范围内线性良好。Hg在0.5～20 ng·mL-1范围内线性关系良好,见表2。
表2 重金属元素标准曲线
2.5 方法学考察
精密度实验。取混合对照品溶液分别连续进样6次测定各元素含量,各元素的RSD值为0.76%～2.09%,表明仪器的精密性良好。
稳定性实验。分别取同一份白芍样品的待测溶液,分别于0、4、8、12、16、20、24 h测定各元素的含量。RSD值为0.78%～2.11%,表明待测溶液在24 h内稳定。
重复性实验。分别精密称取同一份白芍和土壤样品各6份,制成供试品溶液,测定各元素的含量,其RSD值为1.38%～4.01%,说明方法的重复性良好。
加样回收率实验。分别精密称取已测定的白芍样品0.1 g,6份,精密加入一定量的各元素的对照品溶液,测定其含量,计算各重金属元素的回收率,回收率为92.80%～106.40%,RSD值为1.98%～3.29%,说明方法的准确性高。
2.6 样品的重金属元素测定
按照2.4.1项下方法制备白芍、芍药根、须根、栓皮和土壤的供试品溶液。在设定的实验条件下,测定所有样品中重金属元素的含量。用SPSS 22进行统计分析。
2.7 安全性评估的计算
(1)靶标危害系数(target hazard quotients, THQ)是美国国家环境保护局提出的一种用于评估人体通过食物摄取重金属产生非致癌风险的方法[6],计算每份样品的重金属THQ。
其中,C为污染物中重金属质量分数(mg·kg-1);EF为每年暴露于毒物(此处指白芍、栓皮、芍药根和须根中重金属)的时间(天数,每年EF设定为30 d);ED为暴露于毒物(此处指含重金属中药材)的时间(年数,30年);FIR为每日摄取含污染物的食物量(成人按平均每天服用5 g计,儿童按2 g计);WAB为人体平均体质量(采用国际通用标准,成人为55.9 kg,儿童为32.7 kg);AT为平均接触非致癌毒物(此处指含重金属中药材)的时间,为平均人寿命70年×365。RfD为口服参考剂量,本应由USEPA提供,但由于USEPA仅给出了无机砷的RfD,因此参考ISO 18664和药典中残留重金属的限量指导原则规定,此处在计算时,选用了由WHO提供的暂定每周耐受摄入量(provisional tolerable daily intake, PTWI)[7-12]:Cu为0.28 μg·g-1,Pb为25 ng·g-1,As为15 ng·g-1,Cd为7 ng·g-1,Hg为5 ng·g-1。
(2)综合危害指数(hazard index, HI)由于中药中同时存在多种重金属,故用综合危害指数评估其非致癌风险,公式为HI=THQPb+THQCd+THQHg+THQAs。其中,HI是非致癌风险综合危险指数,THQPb是Pb的靶标危害系数,THQCd是Cd的靶标危害系数,THQHg是Hg的靶标危害系数,THQAs是As的靶标危害系数。
3 结果与分析
3.1 白芍加工前后不同部位重金属元素的比较
药典中仅规定白芍重金属的限量标准Pb≤5.0 mg·kg-1,Cd≤1.0 mg·kg-1,Hg≤0.2 mg·kg-1,As≤2.0 mg·kg-1,Cu≤20.0 mg·kg-1。参考该标准,35份白芍和芍药根均合格。须根和栓皮重金属均高于芍药根和白芍,特别是Pb,须根平均含量高达20.43 mg·kg-1,栓皮平均含量高达24.95 mg·kg-1,结果见表3至表5,说明Pb在须根和栓皮部的含量远高于白芍和芍药根。须根和栓皮虽然作为非药用部位,未见重金属的限量规定,但因白芍的主要有效成分在皮部含量较高[13-14],会考虑将其作为白芍新的药用资源开发或以中成药的原料投产。因此,明确其重金属的含量一方面佐证白芍的产地加工对安全性具有重要指导意义,另一方面不建议将栓皮和须根开发为新的药用资源。
表3(续) 白芍与栓皮重金属的综合得分Z值及含量
表4 芍药根与须根重金属的综合得分Z值及含量
表4(续) 芍药根与须根重金属的综合得分Z值及含量
3.2 土壤中重金属元素的分析
土壤样品遵循《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB15618-2018)中的土壤污染风险筛选。Cu、Pb、Cd、Hg均处于土壤污染风险筛选值以下,As有3份土壤(TR24、TR25、TR29分别为58.857、53.833、56.216 mg·kg-1)均超出了风险筛选限量值≤40 mg·kg-1,但均在污染风险管制值以内,结果见表5。测定的35份土壤的重金属含量总体处于风险筛选值以下,说明土壤重金属污染风险低。
表5 芍药根际土壤重金属的含量
3.3 白芍加工前后不同部位对重金属的富集特性
富集系数(BCF)表示植物体从土壤环境富集某元素能力强弱的趋势,在一定程度上反映了沉积物或土壤中无机元素向植物体内迁移的难易程度,表现了无机元素在植物体内的富集情况[10]。其计算公式为BCF=C植物体/C土壤,式中C植物体为植物体内某一部位(BS、SY、XG、SP)的无机元素含量(mg·kg-1),C土壤为土壤中对应的无机元素含量(mg·kg-1)。当重金属数BCF<0.1时表示强烈贫化,BCF<0.5时相对贫化,0.5
表6 白芍加工前后不同部位重金属BCF及平均含量
3.4 白芍加工前后不同部位重金属的主成分分析
将白芍、芍药根、栓皮和须根样品的重金属元素含量的结果输入SPSS 22统计软件,设置提取因子数量为5,进行主成分分析,得到总方差的解释和成分矩阵,5个主成分的初始特征值分别为2.81、0.85、0.55、0.48、0.31,累积百分比为100%,计算得到Z1、Z2、Z3、Z4、Z5的5个主成分,表达式分别为:
Z1=0.827Cu+0.767As+0.742Cd+0.853Pb+0.505Hg,
Z2=-0.197Cu+0.114As-0.25Cd-0.189Pb+0.836Hg,
Z3=-0.065Cu-0.47As+0.533Cd-0.087Pb+0.188 4Hg,
Z4=-0.395Cu+0.413As+0.39Cd-0.209Pb-0.1Hg,
Z5=0.345Cu+0.074As+0.043Cd-0.431Pb-0.014Hg。
把各主成分相加,得到总的重金属表达式Z=0.517Cu+0.897As+1.386Cd-0.063Pb+1.415Hg,把重金属元素的含量代入Z,得到每份样品的综合得分值,结果见表3至表5。芍药根与须根相比,芍药根的综合得分值为2.8～7.2,平均值为4.7(n=35);须根的综合得分值为4.0～16.4,平均值为6.4(n=32)。加工后白芍与栓皮比较,白芍的综合得分值为2.3～5.6,平均值为3.3(n=35);栓皮的综合得分值为5.1～14.5,平均值为8.9(n=35)。白芍与芍药相比,综合得分更低。以重金属元素主成分分析的综合得分为指标,综合得分越高,安全性越低。安全性从高到低依次为白芍、芍药根、须根、栓皮,说明水煮去皮等加工方式有利于降低药材中的重金属含量,使药材的安全性更高。
3.5 白芍、栓皮、芍药根和须根的安全性评估
根据《中草药重金属限量国际标准(ISO 186642015.8.1)》规定[17],THQ<1时,认为人体负荷的重金属量对人体健康未造成明显影响,否则认为人体所负荷的重金属量已危害到人体健康。药物THQ的计算应考虑每人每天摄入药物所占食物的比例(成人1.5 kg,儿童0.8 kg)[18-19]。当THQ(或HI)<8×10-3,即可认为其所含重金属量不会对成人健康有明显影响;当THQ(或HI)>8×10-3,表明重金属摄入水平高于安全限值,通过中药摄入的重金属对成年人人体有一定风险,应引起重视。THQ(或HI)<7.5×10-3,对儿童健康无明显影响;THQ(或HI)>7.5×10-3,表明重金属摄入水平高于安全限值,通过中药摄入的重金属对儿童有一定风险,应引起重视。
白芍的各重金属的THQ和HI对成年人和儿童暴露人群健康均无明显影响。芍药根有1份样品的THQPb对成人和儿童暴露人群健康均有明显影响;HI中有14份样品对成人暴露人群健康有影响,11份样品对儿童暴露人群健康有影响。须根THQCd结果中有4份样品对成人暴露人群有明显影响,有1份样品的Cd对儿童暴露人群有明显影响,所有的THQPb和THQCu对成人和儿童暴露人群均有明显影响。HI结果中所有须根对成人和儿童暴露人群均有明显影响。栓皮安全性评估结果中,1份样品的THQAs和4份样品的THQCd对成人暴露人群有影响,1份样品THQCd对儿童暴露人群健康有明显影响,全部样品的THQCu和THQPb对成人和儿童暴露人群的健康均有明显影响。HI中,全部的栓皮对成人和儿童暴露人群均有明显影响,结果见表7至表10。
表7 成人及儿童服用不同批次白芍时摄取重金属的THQ和HI
表8 成人及儿童服用不同批次芍药根时摄取重金属的THQ和HI
表9 成人及儿童服用不同批次须根时摄取重金属的THQ和HI
表10 成人及儿童服用不同批次栓皮时摄取重金属的THQ和HI
对成人而言,须根的平均THQPb(43.3×10-3)、HI(52.5×10-3)均大于8×10-3,栓皮的平均THQPb(52.8×10-3)、THQCu(35.8×10-3)和HI(96.6×10-3)均大于8×10-3,说明须根和栓皮对暴露的成年人健康有明显影响。对儿童,须根的THQPb(37×10-3)、HI(44.9×10-3)均大于7.5×10-3;栓皮的THQPb(45.1×10-3)、THQCu(30.6×10-3)和HI(82.6×10-3)均大于7.5×10-3,说明须根和栓皮对暴露的儿童健康有明显影响。芍药根与须根相比,重金属的THQ及HI均较低;白芍与栓皮相比,重金属的THQ及HI均较低,见表11、表12。说明白芍和芍药根重金属对人体健康影响更小、更安全,与主成分分析结果一致。
表11 成人服用白芍加工前后不同部位时摄取重金属的THQ均值及HI
表12 儿童服用白芍加工前后不同部位时摄取重金属的THQ均值及HI
4 讨论
本项目用ICP-MS法测定白芍加工前的芍药根(n=35)、须根(n=32)及其根际土壤样品(n=35)与加工后的白芍(n=35)和栓皮(n=35)中重金属元素Pb、Cd、Hg、As、Cu的含量。发现白芍和加工前的芍药根重金属均在安全限量范围内,而须根与栓皮的Pb含量远高于白芍和芍药根。富集特性表明,须根与栓皮对Cd存在相对富集。重金属的主成分分析和安全性评估表明,须根与栓皮中Pb存在安全风险。重金属测定结果表明,白芍和加工前的芍药根安全,可入药使用;但须根和栓皮中Pb含量高并且对Cd相对富集,存在安全风险,不建议作为药材替代白芍或作为原料药使用。
芍药的须根与栓皮对Cd存在相对富集。有研究表明,不少药用植物对重金属元素都有不同程度的富集作用,半夏对土壤的Cd具有明显富集作用[20];根和根茎类药材丹参、蒌蒿和姜黄等,茎叶类药材艾纳香、青蒿,花类药材的菊花和红花等的Cd含量超标率较高[21-24]。此外,中药材中Pb含量超标率较高,有报道麦冬、甘草、续断、半夏、姜黄等药材的Pb超标[25],说明Cd和Pb在我国不同品种及药用部位的中药材中普遍存在。重金属超标是目前中药临床安全用药的关键问题。我国中药材重金属污染是一个长期而复杂的问题,与中药材产地、品种、入药部位、生长环境等诸多因素有着密切的关系。不同药用植物入药部位不同,重金属污染水平也不同,究其原因除了与在生长过程中暴露在重金属污染环境中的时间长短有关,还与其不同部位对重金属元素的吸收富集能力有关。
中药材中富集的重金属通过口服等途径进入人体内,使人慢性中毒。人体内Pb积累超过负荷值,会导致神经系统、造血系统、血管和消化系统等损伤[26-27];Cd在人体内积蓄可能会引起畸形、癌变,Cd及其部分化合物已被国际癌症研究机构列为I类致癌物质[28]。在安全性评估中,无论是THQ,还是HI,表明白芍和芍药根的重金属含量均在安全范围,对人体健康的影响程度低;而须根与栓皮中Pb和Cd具有潜在的健康风险。
为保证中药材质量,应积极推行在生态环境良好的地区建立中药材生产基地,首先加强药材生产基地的土壤环境质量管理,加大产地土壤环境重金属的监测力度,实施测土栽培,为全面规范化、标准化药用植物栽培提供基础条件;其次开展Pb等重金属对药用植物生长与品质影响的机制研究,明确土壤中Pb的形态分布以及Pb在药用植物体内的富集与迁移规律,为药用植物质量安全风险评估提供理论依据;三是强化药材产地土壤重金属Pb污染治理与修复技术研究,为全面提高药材质量安全水平提供技术保障。避免中药材在种植、采收、炮制加工、运输、贮藏等过程中被污染。今后对中药材重金属的研究还应深入开展,一方面,建议进行Pb、Cd最小有毒剂量研究,并与Pb、Cd在体内代谢研究相结合,从而科学地探索Pb、Cd限量标准,为制订统一的中药材限量标准提供理论依据。另一方面,以水溶态为主的Cd能够以被水溶洗的方式去除,因此,芍药在加工成白芍经水洗和水煮的过程中Cd含量已降低。为更客观地评价白芍的安全性,建议进一步研究Cd在芍药根加工和炮制过程的转移率及残留量。
