玉米紫色叶突变体zmpl-1表型分析及基因定位

朱振兴,郭长英,李 丹

(辽宁省农业科学院作物分子改良实验室,辽宁 沈阳 110161)

叶片是植物接受阳光,进行光合作用最重要的组织器官。一般植物叶片颜色,因富含叶绿色叶片呈现绿色。在一些外界环境下刺激或胁迫下,如到了秋季气温变低,叶绿素逐渐降解,当花青素的含量多于叶绿素时,叶片就会呈现紫色;在缺磷的条件下,植物会合成更多花青素,叶片也变成紫色[1]。因此,紫色被认为是花青素的标识物,花青素属于黄酮类物质,是广泛存在于植物体内的一种天然色素,在植物着色以及抗氧化上具有重要作用。也因此可以保护人体免受自由基氧化的损伤、增加皮肤光滑度、保护肝脏、保持血管弹性等,是抗氧化、抗衰老的重要活性物质[2]。叶色突变体是开展叶片颜色调控基因功能及光合作用研究的重要材料。在植物中已经发现的叶色突变体多种多样,包括多种类别,有浅绿叶、黄化转绿叶、黄化叶、白化叶、条纹叶以及紫色叶等[3~7]。紫色叶突变体是研究花青素生物合成调控的重要材料。另外紫色叶容易识别,对植株生长发育影响小等特点,也被应用到品种制种去杂、纯度鉴定等育种过程中,可以减少田间人工去杂工作量,极大的提高去杂效率[8]。玉米是中国的第一大作物,在国民生活及经济中占有重要地位。尽管玉米花青素生物合成途径可能与其它物种中分子机制相似[9],但缺乏详实的数据,还有很多不清楚的地方。发掘、研究玉米紫色叶片突变体,可以补充、完善玉米花青素合成的分子机制,也可为制种去杂提供标记材料。

尽管叶色突变体在不同物种中报道了很多,但紫叶相关突变体报道相对较少[10]。紫叶突变体在水稻、小麦、油菜等作物中有少量报道。水稻中克隆了1个位于第6条染色体上的紫叶控制基因OsPL6,编码了1个MYB转录因子[11]。在该基因的5’UTR非翻译区鉴定到3个 SNP和1个6 bp的缺失。研究发现正是该非翻译区的变异,导致该MYB转录因子表达的上调,继而促进了花青素合成途径中结构基因的上调表达,包括OsCHS、OsPAL、OsF3H以及OsF3’H基因表达都显著的被提高,从而促进了花青素积累。水稻中的另1个紫色叶调控基因OsPL,位于第5条染色体上,同样也编码了1个MYB转录因子。该基因第3个外显子上插入了1个碱基,造成了该编码基因移码突变[12]。该基因的突变造成植物叶片中花青素含量增加,叶绿素减少。与之相对应的是较野生型,花青素合成基因OsPAL、OsCHS、Os-ANS以及OsMYB55显著上调表达,而光合相关基因表达都被下调。在小麦中报道的1个低温敏感的紫条纹突变体psl1[13],在低温下显示紫色,花青素积累多而叶绿素和胡萝卜素降低,而在高温条件下则表现为正常绿色。遗传分析表明,psl1表型受细胞质遗传控制。荧光定量实时PCR结果显示出,低温条件下在相对幼嫩的叶片中叶绿体发育相关基因psbA和psbC基因下调最多。油菜中克隆了1个能提高紫叶芥菜花青素含量基因BjPur,该基因编码 1个R2R3-MYB转录因子[14]。紫叶亲本(ZY)与绿叶亲本(LY)中的BjPur基因序列比较发现,紫叶亲本中的BjPur基因的第一个内含子中有1个较大的插入,造成BjPur基因在紫叶植株中表达显著被提高,而且该基因在叶中的表达量远高于根中。

本研究从在本实验室构建的EMS人工诱变玉米B73突变体库中,筛选到1份特异的玉米紫色叶突变体,命名为zmpl-1。拟通过构建F2定位群体,分析紫色叶突变体控制基因的遗传特性,并通过重测序BSA-seq定位该基因位置,以其为解析玉米花青素形成分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及种植条件

玉米紫色叶突变体zmpl-1,玉米品种 Mo17。小钵盆栽实验于2021年3月在辽宁省农业科学院人工气候箱中(泽大仪器有限公司)开展,12 h光照/12 h黑暗,将催完芽后的玉米种子播种于灭菌的营养基质中(购置于沈阳农业大学工厂化技术服务中心),然后正常浇水,培养至指定天数。F2材料2021年5月常规种植于试验地中,种植大概行距40 cm,行长 2 m,株距 20 cm,其它与一般大田管理,正常浇水、施肥、虫害管理等。

1.2 叶片花青素含量测定

于2021年3月取叶片鲜样约0.1 g,提取液为0.1 mol/L的盐酸乙醇溶液(1 L溶液含有8.3 ml浓盐酸其余用95%乙醇稀释)。首先将叶片置于2 ml离心管,加入一颗4 mm直径陶瓷珠(因溶液呈酸性注意不要使用金属小球)以及1ml提取液,于植物组织研磨仪上以频率 50破碎1 min(上海静信实业发展有限公司 Tissuelyser-64L组织研磨仪)。然后转入50 ml离心管中并加入9 ml提取液,于60℃温育提取30 min,然后加入5 ml提取液继续浸提15 min,再次加入5 ml提取液继续浸提15 min,最后用提取液定容至25 ml,全程注意避光。其后在分光光度计上(日本岛津 UV2600)分别检测530 nm、620 nm以及650 nm波长处的光密度值,然后按照Greey公式计算花青素含量,花青素含量(nmol/g)=[(OD530-OD620)-0.1×(OD650-OD620)]×V/W/(4.62×104)×1 000 000,其中 V,提取液加入总体积(ml);W,重量(g);4.62×104为花青素摩尔消光系数。

1.3 DNA提取及BSA-seq

在B73背景紫色叶突变体zmpl-1与Mo17杂交组配的F2群体中,分别取野生表型14份植株,突变体表型植株14份叶片,然后进行基因组DNA提取,提取采用植物高效基因组DNA提取试剂盒DP350(天根生化科技有限公司)。纯化出来的基因组DNA采用两种方法进行浓度和质量的检测,一是0.8%琼脂糖凝胶电泳,要求基因组DNA条带清晰、锐利,无明显拖尾;二是采用Nanodrop(美国赛默飞世尔科技公司)测定 DNA质量和浓度,挑选出的样品要求280/260,260/230比值在1.8~2.2之间。利用重测序技术进行BSA-Seq时,两个混池按照每个样品基因组DNA使用总量100 ng均一混样即可,每个样品浓度要求在 50 ng/μl左右。检测合格的基因组DNA混样,送到北京普朗泰科生物科技有限公司进行高通量测序分析。

测序出来的原始序列过滤掉接头序列、低质量序列等,得到Clean Reads,用于后续分析。bwa软件将重测序获得的短序列reads定位到参考基因组上(zea_mays.V4,ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-41/fasta/zea_mays/dna/)。通过比对定位Clean Reads在参考基因组上的位置,统计各样品的测序深度、基因组覆盖度等信息,并进行变异的检测。利用GATK软件工具包检测SNP(Single Nucleotide Polymorphism)。性状关联分析采用欧式距离(Euclidean Distance,ED)算法[18],利用测序数据寻找混池间存在显著差异的标记,并以此评估与性状关联区域的方法。在进行分析时,利用两混池间基因型存在差异的SNP位点,统计各个碱基在不同混池中的深度,并计算每个位点ED值。利用标记在基因组上的位置,对同一条染色体上标记的ED值进行拟合,并根据关联阈值,选择阈值以上的区域作为与性状相关的区域。

2 结果与分析

2.1 表型观察及花青素含量测定

该突变体仅叶尖及叶缘部位呈现紫色,而叶片其它部位颜色较野生型 B73无明显差异(图1A,B以及F)。在14 d苗龄时,突变体第1、2片全展叶在叶尖呈现紫色,特别是第2片全展叶(图1A和图1B)。第2片全展叶的花青素含量测定表明zmpl-1突变体叶片中花青素含量较野生型显著增加,大概为野生型叶片中含量的10倍(图1C)。在吐丝期时,观察突变体表型发现,该紫色叶片的面积在老叶中比较大,而在相对幼嫩的叶片中逐渐减少,最上面的6片叶中上几乎观察不到紫色,而最后的5片叶片中,紫色叶片在叶尖及叶缘范围依次增加(图1D~F)。

图1 野生型B73和zmpl-1突变体植株表型及叶片花青素含量Figure 1 Phenotype and leaf anthocyanin concentrations of wild type B73 and zmpl-1 mutant

2.2 遗传分析

在B73背景的zmpl-1突变体与Mo17杂交的F1植株47株,均呈现出正常绿色叶片,说明该紫色叶性状受隐性基因控制。在吐丝期观察F2群体中植株叶片表型的分离情况,结果显示在种植的F2群体中,叶片表现类似于zmpl-1突变体表型的植株仅有14株,叶片全绿色的植株有962株。

卡方分析表明,F2中紫色叶表型植株与绿色叶植株数量符合63∶1的比例(表1),表明该紫色叶性状可能受3个隐性基因共同调控,而且只有这3个隐性基因都存在的情况下,植株才能显示出紫色叶表型。

表1 zmpl-1×Mo17 F2群体中分离个体遗传分析Table 1 Statistical analysis of phenotype of F 2 population from zmpl-1×Mo17

2.3 BSA-seq重测序数据总概

B73来源突变体zmpl-1与 Mo17杂交组配定位群体,在吐丝期F2群体中挑选14株突变体表型植株以及14株叶片颜色全绿色植株,进行BSA-seq重测序分析。结果表明两个混样池绿色叶混样池(L)以及紫色叶混样池(P),测序总数据量分别高达272 054 640和257 343 500个Clean reads,数据量达到了平均17X和16X的测序深度,而定位到基因组上的Clean reads数比例也高达 90%,说明测序数据量多,质量也高(表2)。

表2 BSA-seq测序数据总概Table 2 Statistical analysis of BAS-seq data

2.4 性状关联分析

性状关联分析采用欧式距离(Euclidean Distance,ED)算法,通过统计各碱基在不同混池中的等位基因频率,计算每个位点的原始ED值。根据关联阈值判定,最终将紫色叶zmpl-1突变体控制基因定位到第2条、第3条、第5条以及第10条染色体上(图2),区间高达207.3 Mb。详细关联到的信息如表3所示,主要定位区域是第2条及第10条染色体上的区间,而第3条与第5条染色体上涉及的定位区域相对较少仅8.8 Mb。

图2 SNP-index值在染色体上的分布Figure 2 Distribution of SNP-index on chromosomes

表3 染色体关联区域汇总Table 3 Summary of associated chromosome region

染色体编号 起始位置 结束位置 区间大小(Mb) 染色体编号 起始位置 结束位置 区间大小(Mb)2 79800000 83100000 3.3 3 234700000 235400000 0.7 2 84300000 88200000 3.9 5 300000 400000 0.1 2 90700000 91900000 1.2 5 900000 5600000 4.7 2 93900000 101300000 7.4 10 6700000 17600000 10.9 2 101500000 109800000 8.3 10 18100000 32600000 14.5 2 110300000 116600000 6.3 10 33800000 37800000 4 2 117500000 117600000 0.1 10 38000000 42800000 4.8 2 117800000 120300000 2.5 10 46300000 47200000 0.9 2 120900000 121100000 0.2 10 47400000 47600000 0.2 2 121600000 124900000 3.3 10 49700000 51400000 1.7 2 130900000 135100000 4.2 10 54100000 67500000 13.4 2 138000000 138400000 0.4 10 69700000 88400000 18.7 2 138600000 138700000 0.1 10 90200000 93700000 3.5 2 146300000 157500000 11.2 10 96100000 100600000 4.5 2 158200000 160300000 2.1 10 109000000 132700000 23.7

3 结论与讨论

花青素是一类植物中广泛存在的天然色素,抗氧化性好,在食品着色、医药、化妆品等方面都有重要用途[3]。紫色一般被认为是花青素化合物的标记性颜色,紫色叶突变体是研究花青素生物合成、调控途径重要的原始材料[11~14]。本研究对EMS诱变玉米B73突变体库中筛选到的紫色叶突变体zmpl-1进行了表型分析、叶片花青素含量测定、遗传和重测序 BSA-seq基因定位分析。表型观察表明,zmpl-1突变体在叶尖及叶缘出现紫色,而且紫色的分布在老叶与新叶不同。花青素测定表明突变体紫色叶片中花青素含量较野生型大幅提高。与 Mo17组配的 F2群体中植株叶片颜色表型遗传分析表明,该zmpl-1突变体紫色叶性状可能受3个隐性基因控制。BSA-seq重测序将该紫色叶性状控制基因定位到4条染色体上207.3 Mb的区间内,包括染色体第 2条、第 10条、第3条以及第5条。

本研究中鉴定的玉米紫色叶突变体zmpl-1,遗传分析表明该性状可能受3个隐性基因调控(表1),而 BSA-seq将该基因定位在四条染色体上(图2),主要是第2条和第10条染色体上的区间,下一步需要重点关注这两个区间。综合紫色叶突变体zmpl-1的遗传分析和定位来看,该紫色叶性状受多个基因控制,而且需要几个基因同时为隐性基因型才能起作用,植株叶片呈现紫色表型。该突变体出现的原因可能是我们在突变体库建立时使用EMS诱变花粉时,使用的剂量较大,容易造成出现多位点突变。在油菜中鉴定到的紫色叶相关调控基因,主要定位在两条染色体上,B04以及B05上。最终克隆了位于B05染色体上BjPur,该基因编码了一个 R2R3-MYB转录因子[14]。油菜中的BjPur基因是半显性基因,而我们玉米突变体zmpl-1是受隐性基因控制,表明该基因的调控的分子路径与油菜BjPur基因很可能不同。而其它几个在水稻中已经发表的紫叶调控基因都与花青素合成途径有关,克隆出来的基因基本都是属于MYB转录因子家族成员[11~12],因此在zmpl-1定位区间搜寻相关MYB转录因子可能是克隆该基因重要方法。从另一方面来说,从zmpl-1受隐性多基因调控,与其它现已报道紫叶调控基因明显不同,我们鉴定的这一份玉米紫色叶突变体zmpl-1属于特异的资源,为解析新的玉米花青素分子路径提供了重要材料。

本研究仅是初定位了玉米突变体zmpl-1,定位区间很大,离基因克隆还有一定距离。下一步需要扩大群体,进行精细定位。尽管我们F2群体取样是在吐丝期,确保了样品表型的准确性,规避了苗期取样易出现表型不准确情况(田间B73野生型苗期可能是冷害或是肥料不均一等原因,容易出现紫色叶片植株)。但是从遗传分析上看紫色叶突变表型可能受3对隐性基因共同调控,在重测序BSA-seq结果却定位到基因组4个区域上,可能由于用于测序植株数量较少,造成假阳性位点的出现。而第2条和第10条染色体上关联到的区间较多,该结果应该可靠,需要进一步精细定位。但由于在F2定位群体中出现紫色叶表型的个体数量非常少,未来精细定位工作量巨大。而且从现在的表型看,如何能定位到这几个基因具有很大的挑战性。在基因定位策略中有一种定位手段叫Mutmap[15],该策略通过与野生型材料回交,可以过滤掉很多干扰位点的影响,然后同样是进行混池法测序,检测 SNP、indel等变异,检测后代基因频率,实现突变位点的定位。因此将来也可以尝试采用回交群体利用Mutmap方法继续进行基因的定位,挖掘候选基因。