褪黑素浸种对滇油杉种子发芽及苗木生长和生理特性的影响

周冬梅，李莲芳，朱存福， 顾 梦，张合瑶，李小军，刘 娴，侯海雄，王文俊

（1.西南林业大学林学院，昆明 650224；2.西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，昆明 650224）

滇油杉（Keteleeria evelyniana）为松科（Pinaceae）油杉属乔木树种，其主要分布于云南，四川西南部和贵州西部等地区，分布区海拔1 400～2 500 m；云南主要以滇中为分布中心[1]。滇油杉干形通直，树形优美，树皮耐火，因此，可用其作为分布区的优质用材林和防火隔离带树种；其耐荫，可与多种树种混交成林[2-5]。在滇中，滇油杉的嫩茎叶作为森林蔬菜食用，可结合森林抚育开展资源有效利用。

滇油杉种子无坚硬的外种皮保护，种皮富含油腺，种子富含油脂，故此，成熟种子贮存期间油脂易氧化，种子容易失去生活力。已有研究指出，滇油杉种子在室温下贮藏，其生活力最长保持时间为6个月，采集制种后采用0.45 g/L IBA和0.30 g/L IAA混合溶液浸种可提高滇油杉种子发芽率（56.0%）和发芽势（27.0%），缩短发芽时间[6-7]。姜若超等[8]发现，0.1 g/L 的GA3和0.05%的壳寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）溶液混合浸种提高滇油杉种子场圃发芽（69.6%）。褪黑素（melatonin, MT）是一种多功能的植物生长调节剂，其广泛存在于动植物体内[9]，具有极强的抗氧化功能，有效缓解活性氧积累的伤害，保护细胞结构，清除自由基[10]。已有研究发现，褪黑素可以有效缓解盐胁迫、干旱胁迫、镉胁迫、低温和高温等胁迫的伤害[11-14]。黎力乙等[15]指出，150 mmol/L NaCl溶液胁迫下，0.1 mmol/L褪黑素浸种对苜蓿（Medicago sativa）种子缓解盐胁迫极为有效。王慧等[16]采用褪黑素溶液叶面喷施和根施干旱胁迫的黑麦草（Lolium perenne）和苜蓿植株，黑麦草的生物量分别增加14.5%和29.6%，苜蓿的则增加36.6%和49.1%；提高黑麦草和苜蓿的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）活性以及N、P 含量，减少叶片中丙二醛（malondialdehyde, MDA）的积累，抗氧化能力和保护酶活性显著提高。向警等[17]在水稻（Oryza sativa）种子的试验中发现，0.2 mmol/L的褪黑素溶液浸种后，可有效缓解盐胁迫对水稻种子的伤害，提高种子的发芽率、发芽势、主根长及CAT活性；0.4 mmol/L的褪黑素溶液浸种后则有效提高种子的SOD和POD活性。

目前，滇油杉在其分布区森林面积较小，且碎片化，人工林培育是恢复其森林植被的主要途径，苗木培育是造林的基础。虽然已有滇油杉种子发芽和苗木培育的相关试验研究，但促进种子发芽的措施仅开展生长激素浸种等方面的研究。本研究基于滇油杉种子富含油脂而易氧化的特性，采用不同浓度的褪黑素溶液浸种，了解外源褪黑素对滇油杉种子发芽和苗木抗氧化能力的影响，为滇油杉种子发芽及苗木培育提供科学依据，丰富褪黑素在种子发芽方面应用的相关资料。

1 材料和方法

1.1 试验地概况与材料

试验于2022 年3 月底在西南林业大学林学院苗圃（102°45＇E，25o03＇N；海拔约1 890 m）中进行，其属亚热带低纬度高原山地季风气候，日照长，霜期短，年均气温约14.7 ℃，年均降水量1 035 mm，年均相对湿度68.2%，年均日照时长2 200 h；土壤类型为山地红壤[18]，试验地位于滇油杉的分布中心。滇油杉种子于2021年12月采自宜良县国有花园林场（103°14＇E，24°92＇N；海拔约1 700 m），制种后测定的种子生活力为40.0%，种子贮藏于通风干燥的室温条件下，播种时种子已在室温下贮藏4 个月。褪黑素购自上海源叶生物科技有限公司（CAS 号S20287）的分析纯粉剂，采用无纺布容器（9 cm×9 cm）进行发芽和苗木培育。

1.2 试验设计

根据已有文献和本试验的种子特性确定褪黑素的浓度梯度，其浓度为0.3～1.2 mmol/L，并增加1个不处理的对照（表1），采用单因素完全随机设计进行试验实施，试验共5个处理，每处理450粒种子（3次重复，每重复150粒）。

表1 试验的因素水平表Table 1 Factorial levels of the trial

试验前平整苗床，将采集的苗圃土分装入容器中，采用0.5% KMnO4溶液对基质和苗床进行消毒。选取大小一致，形态饱满的滇油杉种子，按试验设计分别用纱布包裹后置于不同浓度褪黑素溶液中浸种12 h，浸种结束后，将种子播入无纺布容器中，每处理90 个无纺布容器，每个容器中播种5 粒种子，播种后均匀覆盖一层基质并浇透水，搭建塑料拱棚，保证种子发芽所需温度，拱棚上覆盖遮阴网。发芽和苗木培育期间定期浇水除草。

1.3 指标测定

种子发芽后，每2 d 记录1 次发芽数；待发芽结束后，计算发芽率（%）、发芽势（%）、平均发芽时间（d）和发芽指数（粒/d）。发芽指标的计算公式如下[19]：

式中，n为测定时间内正常发芽的种子数；N为置床的种子数；N0为日发芽种子数达到最高峰时正常发芽的种子数；di为从播种之日算起的天数，ni为相应各日正常发芽粒数。

苗龄65 d 时，测定其幼苗生长和生物量，具体方法为苗木取回实验室后测定地径、苗高、胚轴长和针叶数，之后每株编号分根、茎、叶测定生物量鲜重，分单株按编号密封于信封内置入120 ℃烘箱内杀青2 h，再调至50 ℃烘干至恒重，称其烘干重，计算根、茎、叶的含水率。生长和生物量测定的同期，每处理选择3～5 株苗木，随机剪取一定数量的针叶混合，称取0.2 g针叶，采用乙醇浸提法[20]，测定其叶绿素和类胡萝卜素含量；MDA 含量、CAT、POD 和SOD 活性使用苏州格瑞思生物科技的试剂盒采用硫代巴比妥法[21]、紫外吸收法[22]、愈创木酚比色法[21]和WST-8 法[21]于紫外分光光度计（UV-6100 Double Beam Spectrophotometer）上进行测定。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 26.0 软件进行数据整理和分析。处理间若指标呈现显著或极显著差异，采用邓肯氏（Duncan＇s）法进行多重比较；相关性采用Pearson法分析[23]。

2 结果与分析

2.1 不同褪黑素溶液浓度浸种对滇油杉种子发芽的影响

不同浓度褪黑素溶液浸种的滇油杉种子发芽率和发芽势分别为41.5%～60.0%和14.5%～32.1%，CK的则为40.4%和15.2%；低浓度（0.3 mmol/L）褪黑素处理的发芽率和发芽势显著高于对照的（P发芽率=5.50E-05＜0.01，P发芽势=9.42E-07＜0.01），与对照相比提高了48.5%和111.2%，发芽率和发芽势随着褪黑素浓度的升高呈现下降的趋势（图1），结合此二指标，说明低浓度的褪黑素溶液浸种有利于种子发芽。

褪黑素处理的平均发芽时间和发芽指数分别为12.6～14.6 d 和4.5～7.2 粒/d；CK 的 为13.3 d 和4.2粒/d，其中，1.2 mmol/L的平均发芽时间显著地长于其余处理的（P=1.10E-02＜0.05），该浓度浸种延长种子发芽时间，降低发芽率；发芽指数与平均发芽时间相一致，随着褪黑素溶液浸种浓度提高而降低；综合平均发芽时间和发芽指数，0.3 mmol/L的褪黑素溶液浸种，提高种子发芽率和发芽势的同时，实现其发芽整齐一致（图1），即0.3 mmol/L 的褪黑素溶液浸种有益于滇油杉种子发芽。

图1 处理的发芽性状Figure 1 Germination indexes of treatment

2.2 褪黑素浸种对滇油杉幼苗生长及其器官含水率的影响

2.2.1 苗木生长

苗龄65 d 时，褪黑素处理的地径、苗高、胚轴长、主根长和针叶数分别为0.8～0.9 mm、6.7～7.6 cm、3.0～3.6 cm、7.4～9.9 cm 和17.0～23.0 针/株（对照的分别为0.9 mm、6.5 cm、4.3 cm、7.4 cm 和15.8针/株），其苗高和针叶数优于对照；处理间，0.3 mmol/L 褪黑素溶液浸种的主根长显著长于除1.2 mmol/L 以外其余处理（P=5.10E-02＜0.05），针叶数也是该浓度的最多；对照的胚轴较褪黑素浸种的长（表2）。种子培育的滇油杉苗木，其地上部分为萌蘖芽形成的无性系苗木，较长的胚轴推迟萌蘖芽形成，影响苗木生长，因此，褪黑素溶液浸种缩短胚轴，促进萌蘖芽快速发育，提高种子发芽和促进苗木生长。

2.2.3 苗木含水率

褪黑素处理的根、茎和叶的含水率分别为70.8%～75.7%、78.7%～80.7%和75.2%～84.8%，对照的分别为67.0%、76.3%和74.3%，褪黑素处理的均高于对照的；处理间，0.3 mmol/L褪黑素溶液浸种的针叶含水率显著地高于其余处理的（P=1.30E-02＜0.05；表2），即褪黑素溶液浸种同时可调节滇油杉幼苗的器官含水量。

表2 滇油杉幼苗生长及其器官含水统计Table 2 Statistics of seedling growth and water contents in organs of K. evelyniana seedlings

2.3 褪黑素溶液浸种对滇油杉幼苗叶绿素和类胡萝卜素的影响

与生长测定的同期，褪黑素溶液浸种处理的叶绿素和类胡萝卜素含量分别为0.96～1.43 mg/g 和0.16～0.23 mg/g（CK 的为0.98 mg/g 和0.21 mg/g）；与发芽性状和生长相同，0.3 mmol/L 褪黑素溶液浸种的叶绿素含量极显著地高于其余处理的（P=1.75E-05＜0.01），说明该浓度处理后，对种子发芽、叶绿素积累及苗木生长有着重要作用，随着褪黑素浓度的升高叶绿素含量呈逐渐下降的趋势；与叶绿素含量不同，0.9 mmol/L 处理的类胡萝卜素含量极显著高于其余处理的（P=4.18E-04＜0.01），随着褪黑素浓度的升高，类胡萝卜素含量呈现先增后降的趋势（图2），表明叶绿素和类胡萝卜素合成对褪黑素浸种浓度的响应不一致，但浓度都不宜较高。

图2 滇油杉幼苗叶绿素和类胡萝卜素含量Figure 2 Chlorophyll and carotenoid contents of K. evelyniana seedlings

2.4 褪黑素溶液浸种对滇油杉幼苗抗氧化酶的影响

褪黑素溶液浸种处理的滇油杉幼苗叶片SOD、POD 和CAT 活性分别为210.8～360.7 U/（g·min）、24.4～64.9 U/（g·min）和1 754.6～1 916.3 U/（g·min），CK 的分别为185.4 U/（g·min）、34.8 U/（g·min）和1 532.1 U/（g·min），其中，褪黑素处理的SOD和CAT活性均高于对照的，处理间，SOD、POD 和CAT 活性具有极显著的差异（P=1.20E-06～3.41E-03＜0.01）；0.3 mmol/L 处理的SOD 和POD 活性最高，CAT 活性最高的则是0.6 mmol/L 处理的，但0.3 mmol/L 处理的与其无显著的差异（图3）。综合来说，0.3 mmol/L的褪黑素浸种提高滇油杉幼苗保护酶活性，可以增强对环境变化的抵御能力，促进苗木生长。

褪黑素处理的MDA 含量为9.5～17.0 nmol/g，对照处理的MDA 含量（25.6 nmol/g）显著地高于褪黑素处理的（P=1.13E-02＜0.05），与保护酶活性相一致，0.3 mmol/L 处理的MDA 含量最低（图3）。MDA含量越高，苗木受膜脂过氧化伤害越大，因此，也进一步证明0.3 mmol/L褪黑素处理可以有效清除活性氧，有利于苗木抗性的提高。

图3 不同处理幼苗的抗氧化酶Figure 3 Antioxidant enzymes of different treatment seedlings

2.5 生长和生理指标间的相关性分析

相关分析结果（表3）表明，滇油杉种子发芽率与针叶数、叶绿素含量、SOD 活性、POD 活性之间，叶绿素含量与SOD活性、POD活性之间呈显著或极显著正相关关系（P＜0.05或P＜0.01）；地径和发芽率之间，苗高和地径之间，MDA含量与发芽率、叶绿素含量、SOD 活性之间显著或极显著负相关关系（P＜0.05 或P＜0.01）。表明经褪黑素溶液处理种子，滇油杉种子发芽性状、幼苗器官生长及其含水率、幼苗生理特性间既有相互促进的，也有相互抑制的，可根据其相关性，选择适宜浓度的褪黑素溶液浸种提高种子发芽性状和苗木生长。

表3 滇油杉幼苗生长指标和生理指标间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between growth index and physiological index of K. evelyniana seedlings

3 讨论与结论

3.1 讨论

生理后熟是指种子的种胚在形态上看似发育完全，但种胚的生理状态不具备发芽条件的现象[24]。王严严[25]发现，额敏贝母（Fritillaria meleagroides）种子形态成熟后存在生理后熟现象，其中内源抑制物可能是导致生理休眠的原因。刘自刚等[26]研究结果指出，桔梗（Platycodon grandiflorum）开花后55 d时，种子发芽率为53.0%，55～61 d 时，发芽率达93.3%，说明种子具有生理后熟现象。本研究制种后测定的滇油杉种子生活力为40.0%，室温储藏4 个月后播种，褪黑素处理的发芽率为60.0%，对照的40.4%，发芽率均高于生活力，与前述两篇文献的类似，滇油杉种子是否也具有生理后熟现象，需要开展相关的研究进行判断。

种子发芽是苗木培育的基础，其发芽性状直接影响后期的苗木生长[14]。褪黑素作为一种植物生长调节剂，被广泛用于种子发芽与苗木生长的试验中。已有研究表明，褪黑素有促进种子发芽，提高根系生长发育的作用[15]。刘珂等[27]发现，0.1 mmol/L褪黑素处理后显著改善香椿（Toona sinensis）种子的发芽性状；董秋丽等[28]试验表明，干旱胁迫下，0.15和0.20 mmol/L 褪黑素分别处理12和6 h时，达乌里胡枝子（Lespedeza davurica）种子发芽率最高；李阳[29]研究发现，褪黑素处理棉花（Gossypiumspp.）种子后，可有效缓解NaCl 胁迫对棉花幼苗根系活力的抑制作用，提高其发芽率，促进幼苗下胚轴生长；唐鸿吕[30]研究指出，0.15 mmol/L 褪黑素处理种子，显著提高低温胁迫下甘蓝（Brassica oleraceavar.capitata）种子的发芽率、发芽势和幼苗胚根长，促进幼苗地上部分、地下部分的生长及苗木生物量的积累。本研究中，0.3 mmol/L褪黑素浸种后，极显著地提高滇油杉种子的发芽率和发芽势，随着褪黑素浓度的升高，发芽率呈下降趋势，与前述文献低浓度的褪黑素有益于种子发芽的类似，但本研究改善种子发芽性状的褪黑素浓度略高于文献的，是否更低浓度褪黑素浸种会更有利于提高滇油杉种子的发芽率，有待进一步试验研究。

叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，叶绿素存在于光合膜上[31]。已有研究表明，外源褪黑素处理可提高植物的叶绿素含量。张盼盼等[12]进行褪黑素处理生菜（Lactuca sativa）幼苗的试验指出，褪黑素溶液根施可缓解干旱胁迫对生菜幼苗的伤害，显著增加总根长、地上地下部分干物质质量、叶绿素含量等（P＜0.05）。史中飞等[32]发现低温胁迫下0.1 mmol/L 褪黑素预处理后油菜（Brassica napus）幼苗的叶绿素含量增加28.5%。本研究中，0.3 mmol/L和0.6 mmol/L褪黑素处理显著提高滇油杉幼苗的叶绿素含量和类胡萝卜素含量，与对照相比提高32.7%和9.0%，与史中飞等[32]的研究结果基本一致。随着褪黑素浓度的升高，叶绿素的含量呈下降趋势，即高浓度的褪黑素对叶绿素的合成产生不同程度的抑制，低浓度促进叶片叶绿素合成，这与徐向东等[33]的研究结果相一致，也许叶绿素合成与褪黑素的浓度间存在一个匹配阈值。

已有研究表明，褪黑素可通过提高植物的抗氧化能力而降低逆境引发的氧化胁迫对植物生长发育的影响[34]。古咸彬等[9]发现，中低浓度（0.1～0.2 mmol/L）褪黑素通过抑制H2O2和MDA 的生成，增强抗氧化酶的活性，从而缓解干旱对桃（Prunus persica）苗木的氧化伤害。施雨[35]发现，低浓度褪黑素处理后，苜蓿种子中MDA含量随褪黑素浓度的增加先下降后上升。刘建龙[36]研究表明，褪黑素浸种后，显著降低干旱胁迫下番茄（Solanum lycopersicum）幼苗叶片中的MDA 含量，增加SOD、CAT 和POD 活性。张娜等[37]的试验研究指出，褪黑素处理后，可有效提高NaCl 胁迫下狼尾草（Pennisetum alopecuroides）SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶活性，降低MDA 的含量，从而缓解盐胁迫对狼尾草幼苗的伤害。本研究中，未经褪黑素处理的滇油杉幼苗的MDA 含量均高于褪黑素处理的，除1.2 mmol/L 处理的POD 活性低于对照的外，其余POD、SOD 和CAT活性均高于对照的，揭示褪黑素处理后，可以有效清除活性氧，降低膜脂过氧化对滇油杉种子的伤害，提高幼苗的POD、SOD 和CAT 活性，与张娜等[37]研究结果一致。MDA是膜脂过氧化的产物，未经褪黑素处理的滇油杉种子，内部油脂氧化后对种子发芽产生胁迫，从而种子产生的多余自由基导致膜脂过氧化，对种子的发芽产生伤害，也许这是导致未经褪黑素处理的种子发芽率较低的原因。

基于褪黑素可以缓解植物体内受多种因素胁迫的结论[9,11-17,27-30,32-39]，本研究褪黑素处理后，提高滇油杉种子的发芽率和发芽势，促进主根生长，显著提高幼苗的光合色素含量，降低膜脂氧化损伤，抑制MDA 的积累，提高抗氧化酶的活性，有益于苗木生长。

3.2 结论

本试验采用单因素完全随机设计，开展褪黑素不同溶液浓度处理对滇油杉种子发芽及幼苗生长和生理指标影响的试验。褪黑素溶液浸种显著或极显著提高滇油杉种子发芽性状、影响光合色素含量及抗氧化物质的活性（P＜0.05 或P＜0.01）。综合发芽、幼苗生长和生理特性，0.3 mmol/L褪黑素溶液浸种全面提高种子发芽性状、光合色素形成和改善保护酶的活性，促进苗木生长，可应用于滇油杉的种子处理。