叶菜型甘薯资源耐寒性评价体系研究

耿亚林,李 瑶,潘 攀,唐道彬,罗启燕,王季春

(1.西南大学农学与生物科技学院/薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室,重庆 400700;2.彭水县农业技术推广中心,重庆 彭水 409600)

【研究意义】甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.],也称白薯、山芋、红薯、地瓜等,为喜温短日照作物,当气温低于15 ℃时,其地上部生长停滞,气温低于6～8 ℃时,植株出现柔软、萎蔫现象,一旦经霜就会枯死。叶菜型甘薯是指将蔓茎生长点以下长约12 cm鲜嫩茎叶用作蔬菜食用的一种专用型甘薯[1],富含多种营养物质,如维生素C、蛋白质、花色苷、黄酮、膳食纤维、绿原酸等,具有抗肿瘤、保护肝脏、抗氧化等功效[2]。叶菜型甘薯无明显生育期,本可周年生产,但秋冬、早春的低温冷害会阻碍甘薯生长,限制其生产应用。因此,筛选耐寒能力强的叶菜型甘薯品种,利用现代农业保温设施,实现春季提早栽培、秋季延后采摘,是解决甘薯生产中低温冷害难题的重要途径。建立一套快速、准确的种质资源耐寒性评价体系,对选育耐寒性强的叶菜型甘薯品种、扩大叶菜型甘薯种植规模意义重大。【前人研究进展】植物处在逆境时,体内会产生一系列适应性生理生化反应,如活性氧含量大幅增加、细胞膜脂过氧化程度加剧等,进而影响生物膜及其他大分子结构和功能,造成代谢失衡,严重时甚至导致植株死亡[3-4]。关于植物的耐寒性,前人已对大白菜、油菜、茄子、甜瓜、青蒿等不同种属作物的耐寒性开展了大量研究,结果表明植物的耐寒能力与其体内抗氧化酶活性、渗透调节类物质含量等密切相关[5-8]。目前,国内外学者已筛选出多个与植物耐寒性评价相关的指标[9],前人多对少数品种的几个生理指标进行耐寒性比较[10-11],但作物抗逆性是受多因子影响的复杂性状[12],易受外界环境影响,不同种类、不同品种的植物耐寒机制也不相同,某一单项指标很难反映植物的耐寒本质[13-14],且许多评价指标之间存在一定的相关性,导致这些指标对植物逆境信息的反映发生交叉重叠,而各指标对抗寒性的反映贡献程度也不相同,因此有必要运用多元分析法对植物耐寒性生理指标进行综合评价,建立可靠的综合评价体系。对甘薯的耐寒性研究,前人多分析了低温贮藏条件下甘薯块根品质的变化[15-17],而对叶菜型甘薯低温胁迫下生理变化的报道较少,关于叶菜型甘薯品种的耐寒性综合评价研究更为鲜见。【本研究切入点】本研究尝试利用多种多元分析方法,比较不同叶菜型甘薯品种的耐寒能力,并探讨其生理生化指标与耐寒性之间的相关性。【拟解决的关键问题】基于各生理生化指标与耐寒性的关系,建立叶菜型甘薯耐寒性评价数学模型,为叶菜型甘薯耐寒种质资源的挖掘,耐寒性品种的选育,快速、准确的耐寒性评价提供依据和方法,以期解决叶菜型甘薯生产中的实际问题,推动叶菜型甘薯产业健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试甘薯品种13个(表1),于西南大学现代农业示范园区4号温室中采用“大棚+小拱棚”育苗,做到同期、同方式育苗。

表1 供试13个叶菜型甘薯品种特征及来源Table 1 Characteristics and sources of tested 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验在西南大学薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室的人工气候培养箱中进行,以13个叶菜型甘薯品种为材料,每个品种3盆,花盆规格为直径18 cm×高20 cm。选用的植株已经完全适应盆栽环境,无缓苗现象,无病虫害,生长健壮。所有处理的栽培基质、管理方法一致。基质配方为草炭土、椰砖、蛭石(体积比为1∶1∶1),营养液参考日本园试配方[18],利用人工气候培养箱模拟低温环境(表2),以25 ℃为对照,研究在10 ℃低温胁迫下甘薯叶片生理生化指标的变化。

表2 人工气候培养箱相关参数设置Table 2 Relevant parameter settings of artificial climate incubator

1.2.2 测定指标 移入人工气候培养箱24 h后取样,取样部分为地上部倒3、倒4完全展开叶,取样后立即用液氮速冻,放入-80 ℃冰箱保存备用。过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性测定采用愈创木酚氧化比色法[19];抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性测定采用抗坏血酸比色法[19];过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性测定采用紫外吸收法[19];超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性测定采用氮蓝四唑法[19];可溶性蛋白(Soluble protein,SP)含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[20];可溶性糖(SS,Soluble sugar)含量测定采用蒽酮试剂法[20];组织含水率(Tissue moisture content,TMC)测定采用烘干法[20];叶绿素(Chlorophyll,Chl)、类胡萝卜素(Carotenoids,Car)含量测定采用分光光度法[20]。

1.3 耐寒性评价及数据分析

用Excel软件进行数据整理和制图,用DPS软件进行相关性分析、主成分分析和聚类分析。

单项指标耐寒系数:CTC=处理测定值/对照测定值×100%

(1)

隶属函数值:U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1, 2, 3,...,n

(2)

(3)

式中,Xj表示第j个指标,Xmin、Xmax表示第j个指标的最小值、最大值;Wj表示第j个指标在所有指标中的重要程度,即权重;Pj表示经主成分分析所得各甘薯品种第j个指标的贡献率。

(4)

式中,D表示叶菜型甘薯品种综合耐寒评价值,综合评价值越大,表示其抗寒性越强。

2 结果与分析

2.1 单项指标耐寒系数及相关性分析

植物遭受逆境时会产生一系列应激反应,其抗氧化酶系统的重要组成部分POD、APX、CAT、SOD等的活性会发生变化。由表3可以看出,与对照相比,不同叶菜型甘薯品种受低温胁迫后的各项生理指标产生了不同程度的变化。13个叶菜型甘薯品种在低温胁迫下的叶片POD、APX酶活性均增加(CTC>1),POD酶活性增加尤为显著,其中福菜薯23、福菜薯18、渝菜薯3号的POD、APX酶活性变化最大,其POD酶活性变化是对照的6倍以上,而福菜薯22、鄂菜薯1号、浙菜薯726的POD、APX酶活性变化较小,表明POD、APX可能是叶菜型甘薯适应低温的主要贡献者;而CAT、SOD这两个起保护细胞膜作用的酶在低温胁迫下均较对照减少(CTC<1),表明这两种酶在低温下没有起到保护细胞的作用。

低温胁迫下,各甘薯品种的叶片可溶性蛋白、可溶性糖含量较对照均有不同程度的增加(CTC>1),增加幅度与品种耐寒性密切相关,即耐寒性强的品种增加幅度大,如渝菜薯3号的可溶性蛋白含量是对照的1.194倍,可溶性糖含量是对照的1.226倍。

叶绿素是植物光合色素中最重要的一类色素,逆境胁迫会使其含量发生变化。低温胁迫下,叶绿素、类胡萝卜素含量有增有减,耐寒性强的品种叶绿素、类胡萝卜素含量较高。产生以上变化的原因:叶绿素、类胡萝卜素含量降低是因为低温胁迫使叶绿素的生物合成减弱,以及植物体内活性氧的积累,导致叶绿素分解加快,进而使叶片绿色变淡;叶绿素、类胡萝卜素含量增加是由于低温胁迫刺激酶保护系统的高效应答,使得部分品种的叶绿体细胞器未受到损伤。进一步分析发现,各品种低温胁迫下的叶绿素a/b较对照均呈增加趋势(CTC>1),表明在叶绿素降解过程中叶绿素a与叶绿素b两者的降解速率不一样,叶绿素b降解更快。

采用不同单项生理指标的耐寒系数来评价甘薯品种的耐寒能力,其评价结果可能存在较大差异。

由表4可以看出,单项生理指标之间存在不同程度的相关性,多数达显著或极显著水平,如POD酶活性与APX酶活性、SP含量、SS含量之间呈正相关(r分别为0.79**、0.65*、0.73**),与CAT酶活性、SOD酶活性呈负相关(r分别为-0.57*、-0.63*);APX酶活性与SP含量、SS含量呈正相关(r分别为0.79**、0.78**),与CAT酶活性呈负相关(r=-0.64*);CAT酶活性与SP、SS含量呈负相关(r分别为-0.63*、-0.63*);SP含量与SS含量呈正相关(r=0.92**);TMC与Chl含量、Car含量呈负相关(r分别为-0.58*、-0.63*);Chl含量与Car含量、Chl a/b比值呈正相关(r分别为0.92**、0.57*);Car含量与Chl a/b比值呈正相关(r=0.55*)。结果表明各单项指标存在不同程度的相关性,具有相关性的两个独立指标对耐寒性的贡献部分有所重叠。

表4 低温胁迫下叶菜型甘薯单项生理指标的相关系数矩阵Table 4 Correlation coefficient matrix of single physiological indexes of leaf-vegetable sweet potato under low temperature stress

综合各项生理指标变化情况,发现各项指标对甘薯品种的耐寒性产生的作用不尽相同,表明耐寒性是一个复杂的综合性状,直接利用单项生理指标不能客观、准确地评价叶菜型甘薯品种的耐寒性,需在此基础上利用主成分分析、隶属函数分析、聚类分析等多元统计方法进一步分析。

2.2 单项生理指标耐寒系数的主成分分析

对10个单项生理指标的耐寒系数进行主成分分析(表5),前4个的贡献率分别为41.842%、29.164%、11.438%和6.138%,累积贡献率达88.582%,其余可忽略不计。这4个相互独立的综合指标基本代表了原始指标携带的绝大部分信息,通过这些综合指标足以说明耐寒系数,故而取这4个主成分作为此次数据分析的有效成分。

表5 单项生理指标耐寒系数的主成分分析Table 5 Principal component analysis of cold tolerance coefficient of single physiological index

2.3 综合指标耐寒系数的隶属函数及聚类分析

由表6可见,对综合指标CI1而言,渝菜薯3号的U(X1)最大,为1,表明在CI1这一综合指标上该品种的耐寒性最强,而福菜薯22的U(X1)值最小,为0,表明该品种在这一综合指标上耐寒性最差。各品种在其余3个综合指标上的耐寒性表现可依此类推。

表6 13个叶菜型甘薯品种的综合指标值及评价Table 6 Comprehensive indexes and evaluation of 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

根据综合指标的贡献率及累计贡献率,用公式(3)计算出4个综合指标的权重(Wj)分别为0.472、0.329、0.129、0.069。采用公式(4)计算甘薯的综合耐寒性评价D值,发现渝菜薯1号的D值最小,表明其耐寒能力最弱;福菜薯18的D值最大,表明其耐寒能力最强。

利用卡方距离类平均法(UPGMA)对D值进行聚类分析,可将13个叶菜型甘薯品种按综合耐寒能力划分为4类(图1):渝菜薯1号为第1类,属于不耐寒型;福菜薯22、浙菜薯726为第2类,属于轻度耐寒型;福薯7-6、万菜薯19号、鄂菜薯1号、万菜薯1号、渝菜薯2号、万菜薯5号为第3类,属于中度耐寒型;福菜薯23、广菜薯6号、福菜薯18、渝菜薯3号为第4类,属于高度耐寒型。

图1 13个叶菜型甘薯品种的耐寒性聚类树状图Fig.1 Cluster dendrogram of cold resistance of 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

2.4 回归方程建立及鉴定指标筛选

为分析各单项生理指标与品种耐寒性之间的关系,筛选可靠的耐寒性鉴定指标,建立可用于叶菜型甘薯品种耐寒性评价的数学模型,将耐寒性综合评价值D值作因变量,各单项生理指标的耐寒系数作自变量进行逐步回归分析,建立最优回归方程:D=0.283+0.0171X1-0.074X3+0.166X4+0.409X5-0.874X7-0.067X8+0.116X9+0.030X10,方程决定系数R2=0.9985,P=0.0001。各品种估计精度均在95%以上(表7),证明方程中的指标对叶菜型甘薯的耐寒性影响显著,可用于叶菜型甘薯品种的耐寒性评价。

表7 13个叶菜型甘薯品种的回归值及精度分析Table 7 Regression value and precision analysis of 13 leaf-vegetable sweet potato varieties

由回归方程可知,10个单项生理指标中有POD(X1)、CAT(X3)、SOD(X4)、SP(X5)、TMC(X7)、Chl(X8)、Car(X9)、Chl a/b(X10)等8个指标对叶菜型甘薯的耐寒性影响显著。因此,可在相同条件下测定叶菜型甘薯品种的上述8个指标并求得其耐寒系数,进而利用该方程预测叶菜型甘薯品种的耐寒性。

3 讨 论

POD、APX、CAT、SOD作为植物抗氧化酶系统的重要组成部分,通过酶活性的提高可以有效清除细胞中富余的活性氧自由基等毒害物质,在维护细胞内环境稳态方面起到至关重要的作用。有研究认为POD、CAT活性随温度降低而升高[21],也有试验表明POD活性随温度降低而降低[22];各品种的SOD活性有不同的变化规律,有增亦有减[23]。崔强旺等[11]对低温胁迫下叶菜型甘薯叶片生理生化变化进行研究,结果显示不同品种的POD、SOD活性变化规律不同,可能是由于品种的耐寒性不同。王萍等[24]对耐寒性不同的两个仁用杏进行8个低温处理(18 ℃为对照),结果表明抗晚霜能力强的仁用杏品种在低温胁迫下的APX活性高出对照最多。范博[25]对小麦进行低温胁迫发现:APX活性与H2O2含量呈正相关,且在清除H2O2的过程中发挥着非常重要的作用。本试验中,甘薯品种的CAT、SOD活性在低温胁迫下均表现出减少的趋势,表明这部分活性氧清除系统尚未被激活,或这两类酶所负责的保护系统已被损伤,没有起到保护细胞的作用;但POD、APX活性增加表明POD、APX可能是叶菜型甘薯适应低温的主要贡献者,尤其POD活性变化大,高达对照的6.6倍,这表明保护酶系统已被激活,只是激活不完全。

低温胁迫下,植物会积累渗透调节物质,如可溶性蛋白、可溶性糖等,这些物质承担着调节细胞渗透压的责任。低温条件下,具有强亲水能力的可溶性蛋白含量增加,使细胞束缚更多水分以阻止原生质结冰,从而提高植物的耐寒能力[26];可溶性糖作为植物体内重要的渗透调节物质和防脱水剂,通过降低细胞水势来增强持水力,对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用,因此常用作抗性筛选指标。武辉等[12]研究表明,低温胁迫下耐寒性强的植物可溶性蛋白和可溶性糖含量增加幅度比耐寒性差的植物大。这与本研究结果一致,低温胁迫下各叶菜型甘薯品种叶片中的可溶性蛋白和可溶性糖含量均有不同程度的增加,且耐寒性强的品种增幅比耐寒性弱的品种大。

低温胁迫导致叶绿体超微结构被破坏,致使叶绿体膜中的光合系统Ⅱ电子传递受阻,叶绿体色素合成酶活性降低,合成叶绿素原料不足,植物机体代谢减缓,叶片中叶绿素含量降低,从而影响植物的光合作用。前人对耐寒性不同的黄瓜和水稻幼苗研究发现:在低温下,细胞器中叶绿体反应最为敏感[27]。本试验结果表明,甘薯叶绿素、类胡萝卜素含量在低温下较对照均有所降低,Chl a/b却呈升高趋势,表明植物受低温胁迫时,叶绿体遭到破坏,叶绿素被分解,因此叶绿素、类胡萝卜素含量降低;而Chl a/b升高可能是由于叶绿素b对低温更为敏感,分解较叶绿素a快,或是叶绿素b与叶绿素a之间完成了某种形态的转化,两者之间的变化关系与转化方式还有待进一步研究。

4 结 论

低温胁迫条件下,不同叶菜型甘薯品种发生不同程度的生理变化,抗氧化酶系统中的POD和APX是保护细胞的主要贡献者;叶片中的可溶性蛋白和可溶性糖含量均有不同程度的增加,且耐寒性强的品种增幅比耐寒性弱的品种大;甘薯叶片的叶绿体遭到破坏,叶绿素被分解,导致叶绿素、类胡萝卜素含量有所降低。

通过隶属函数法和聚类分析将13个叶菜型甘薯品种按照耐寒性强弱划分为4类:不耐寒型、轻度耐寒型、中度耐寒型和高度耐寒型,根据品种的耐寒性可选择适合的季节推广种植,以获得较高的经济效益。通过逐步回归分析法建立了叶菜型甘薯耐寒性评价模型,根据回归方程筛选出POD、CAT、SOD、SP、TMC、Chl、Car及Chl a/b 8个耐寒性鉴定指标。通过测定这些指标,可在相同条件下进行不同叶菜型甘薯品种耐寒性的鉴定和预测。结合隶属函数综合评价模型得出,供试13个叶菜型甘薯品种耐寒能力排名前3的是福菜薯18、渝菜薯3号、广菜薯6号,可在早春推广种植耐寒能力强的品种,使其提早上市,抢占市场。