茵陈蒿的化学成分及其药理活性研究*

何静怡，舒腾云，苏丽花，许 敏

（昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

茵陈是中国传统中药中用于治疗肝病的要药，来源于菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb. 的干燥地上部分。春季幼苗高6～10 cm 时采收或秋季花蕾长成至花初开时采割，除去杂质和老茎，晒干。春季采收的习称“绵茵陈”，秋季采割的称“花茵陈”[1]。茵陈味苦、辛，微寒。归脾、胃、肝、胆经。关于茵陈药理活性的记载最早见于《神农本草经》中，谓其能除“热结黄疸，久服轻身益气耐老”。茵陈作为民间用于治疗肝病单验方中使用频次最多的中药，中医认为其气芳香，有清湿热、退黄疸的功效，临床上主要用来治疗黄疸尿少、湿疮瘙痒、黄疸型传染性肝炎和肝内胆汁淤积等症状[2-3]。

茵陈蒿作为抗肝病中药茵陈的主要植物来源之一，除传统的保肝利胆作用外，还具有抗炎抗病毒等多种功效，其药理作用多样，机制复杂[4]。现代药理学研究表明，茵陈蒿的药理作用主要包括保肝[5-6]，利胆[7]，调脂降压[8]，降血糖，抗动脉粥样硬化[9]，抗肿瘤[10-11]，抗氧化等。为阐明其活性成分，自20 世纪70年代以来，国内外学者对其化学成分进行了大量研究，从中分离鉴定了香豆素[12]、黄酮[13]、烯炔类[14]、有机酸类化合物[15-16]等120 余个化合物，但是迄今为止依然无法解释茵陈蒿作为治疗肝病之要药的科学依据，且现有文献针对其萜类化合物的研究较少，缺乏对茵陈蒿中单体化合物抑制肝癌细胞活性的系统性研究。因此，为了进一步研究茵陈蒿中化学成分及其药理活性，探究中药材茵陈蒿作为治疗肝病之要药的科学依据，该文应用传统的植物化学研究方法，对茵陈蒿的95%乙醇提取物中，萜类化合物含量最多的流份进行了化学成分研究，经分离纯化共得到10 个单体化合物（图1），分别鉴定为（R，Z）-deca-8-en-4，6-diyne-1，3-diol（1）；methyl（S）-8-（5-oxo-2，5-dihydrofuran-2-yl）octanoate（2）；gymnasterkoreayne A（3）；（S）-deca-4，6，8-triyne-1，3-diol（4）；dehydrovomifoliol（5）；loliolide（6）；（3S，5R，6S，7E）3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one（7）；（6R，9R）-3-oxo-α-ionol（8）；trans-4-hydroxylinalool 3，6-oxide（9）；methyl（S）-9-hydroxy-10-undecenoate（10），其中化合物1和2 为新化合物。此外，采用MTT 法测定分离得到的化合物对肝癌细胞的抑制作用，且基于前期文献调研工作，发现茵陈蒿中炔类化合物具有一定抗HBV 活性[14]，本研究论文采用MTT 法和ELISA 法进一步针对茵陈蒿中分离得到的炔类化合物进行抗HBV 活性测试。

图1 茵陈蒿中分离得到的化合物（1-10）

1 实验仪器与材料

1.1 仪器 用Jasco P-1020 数字旋光仪测量旋光度；用KBr 微球在Thermo NICOLET iS10 上测定了红外光谱；高分辨质谱用Agilent 6500 系列Q-TOF液质联用仪检测；核磁共振光谱用Bruker DRX-600核磁共振波谱仪（Bruker Bio-Spin group，Germany）进行测量，使用TMS 作为内标；分析型液相色谱仪Waters 2695/2996（Waters 公司，美国）；制备型液相色谱仪Waters 1525/2998（Waters 公司，美国）；多功能酶标仪（Infinite M200Po，瑞士ECAN 公司）。

正相柱层析采用的材料有200～300 和500～800目的硅胶（青岛海洋化工厂）；反向柱层析采用的材料有MCI-gel-CHP-20P（75～150 μm，三菱化学工业有限公司）；ODS-A（40～63 μm，日本）；薄层色谱采用硅胶板（青岛海洋化工有限公司），显色剂为10%H2SO4-EtOH 溶液；半制备柱采用ACE C18-PFP 和Waters sunfire-C18 色谱柱（5 μm，250 mm × 10 mm）。

1.2 材料 茵陈蒿于2020 年10 月采自中国山西省运城县，经贵州中医药大学吴之坤博士鉴定，确定为茵陈蒿（Artemisia capillaris Thunb.）药材，植物标本已存放在昆明理工大学生命科学与技术学院，标本编号为KMUST-BS-0116。

2 方法与结果

2.1 提取与分离 茵陈蒿全草100 kg，粉碎后用95%的乙醇室温提取3 次，提取时间分别为3 h、2 h、1 h。将该提取物（20 kg）经减压浓缩后悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取3 次，经浓缩，得到乙酸乙酯萃取物5 kg。采用D101 大孔树脂柱层析进行分离，分别用水、30%、50%、70%、90%、100%甲醇洗脱，得到7 个流份Fr.A～Fr.G。为进一步促进茵陈蒿中萜类化合物的研究进展，本文结合薄层色谱TLC 显色结果和LC-MS 数据，选取萜类化合物较多的流份Fr.E 作进一步分离纯化研究工作。

Fr.E（113 g）经硅胶柱色谱进行分离，用二氯甲烷和甲醇系统梯度洗脱（100 ∶0-0 ∶1），得到13 个流份Fr.E1-Fr.E13。Fr.E5（1.34 g）经ODS 柱层析进行分离，用甲醇-水系统梯度洗脱（30%～70%），得到11 个流份Fr.E5-1～Fr.E5-11。Fr.E5-4（500 mg）经半制备HPLC（乙腈-水25%）分离得到化合物5（2.5 mg，tR=17 min），6（5 mg，tR=20 min），7（5 mg，tR=25 min）。Fr.E5-5（76 mg）经半制备HPLC（乙腈-水30%）分离得到化合物4（2.8 mg，tR=10 min），9（3 mg，tR=16 min）。Fr.E6（2.6 g）经硅胶柱层析进行分离，用石油醚和乙酸乙酯系统梯度洗脱（30 ∶1-0 ∶1），得到23 个流份Fr.E6-1～Fr.E6-23。Fr.E6-12（100 mg） 经半制备HPLC（乙腈-水45%）分离得到化合物2（4 mg，tR=17 min）。Fr.E6-17（189 mg）经半制备HPLC（乙腈-水18%）分离得到化合物1（3 mg，tR=27 min），3（2 mg，tR=29 min），8（7 mg，tR=32 min）。Fr.E7（2.8 g）经硅胶柱层析进行分离，用石油醚和乙酸乙酯系统梯度洗脱（40 ∶1-0 ∶1），得到14 个流份Fr.E7-1～Fr.E7-14。Fr.E7-7（102 mg）经半制备HPLC（乙腈-水38%）分离得到化合物10（16 mg，tR=14 min）。

2.2 肝癌细胞活性测试 采用MTT 法测定分离得到的10 个化合物对肝癌细胞HepG2 的抑制作用。用含10%胎牛血清的培养液（DMEM）配成单个细胞悬液，以每孔3 000～15 000 个细胞接种到96 孔板，每孔加入100 μL 细胞悬液，在37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育24 h，使细胞贴壁。吸去旧培养基后，待测化合物用DMSO 溶解，30 μM 为初筛浓度加入板中，继续在培养箱中孵育72 h。吸去培养基，加入配好的MTT 溶液（5 mg/mL），每孔加入20 μL，培养箱中孵育4 h，然后每孔加入200 μL DMSO（二甲基亚砜）避光震摇12 min，使用酶标仪在490 nm 波长下测量吸光度值，记录结果。紫杉醇作为阳性对照化合物。按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率=（[空白组－实验组）/空白组]×100%。

2.3 HBV 活性测试 采用MTT 法测定化合物1，3 和4 对HepG2.2.15 细胞的毒性，用ELISA 法检测细胞上清液中的HBeAg 和HBsAg 抗原分泌。HepG2.2.15细胞接种于48 孔板，3×104细胞每孔，加入生长培养基，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，使细胞贴壁。吸除原培养基，将稀释好的样品加入板中，继续在培养箱中孵育72 h。用MTT 法检测药物细胞毒性，用ELISA 法测定样品对HBeAg 和HBsAg 抗原分泌抑制率，以拉米夫定作为阳性对照。按公式计算细胞存活率和抗原抑制率：细胞存活率=（实验组/空白组）×100%；抗原抑制率=（[空白组－实验组）/空白组]×100%。

2.4 结构鉴定 化合物1：淡黄色油状。[α]2D3-20.0（c 0.10，MeOH）。ESI-MS m/z：187.0729 [M+Na]+（计算值为187.0735 [M+Na]+），推测分子式为C10H12O2，不饱和度为5。红外光谱（KBr）显示有羟基信号（3403 cm-1），炔基信号（2230 cm-1）和碳-碳双键信号（1613 cm-1）。紫外光谱（λmax：239，252，267，283 nm）与烯炔类化合物的紫外吸收吻合。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.21（dq，J=10.8，6.9 Hz，1H，H-9），5.55（d，J=10.8 Hz，1H，H-8），4.60（t，J=6.3 Hz，1H，H-3），3.71 （m，2H，H-1），1.89 （d，J=6.9 Hz，3H，H-10），1.89（m，2H，H-2）。13C-NMR 数据见表1，显示10 个碳信号，包括4 个季碳，3 个次甲基，3 个亚甲基，与化合物gymnasterkoreayne A[17]对比1H-NMR，13C-NMR 数据基本一致，除了H-8 和H-9 之间耦合常数由15.8 Hz 变为10.8 Hz，故判断8 位双键的构型为Z 型。由于该化合物具有一个手性碳（C-3），为进一步判定其绝对构型，我们对其比旋光度进行了测定，结果为 [α]23D-20.0（c 0.10，MeOH），与原文献[α]2D3-14.0（c 0.1，MeOH）基本吻合，综上所述，化合物1 鉴定为（R，Z）-deca-8-en-4，6-diyne-1，3-diol.

化合物2：无色油状。[α]2D44.30（c 0.25，CHCl3）。ESI-MS m/z：263.1247 [M+Na]+（计算值为263.1259[M+Na]+），推测分子式为C13H20O4，不饱和度为4。红外光谱（KBr）显示有羰基信号（1756 cm-1）和碳-碳双键信号（1601 cm-1）。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.72（dd，J=5.8，1.5 Hz，1H，H-3），6.13（d，J=5.8 Hz，1H，H-2），5.14（m，1H，H-4），3.65（s，3H，H-13），2.32（t，J=7.4 Hz，2H，H-11），1.86-1.29（m，12H，H-5-H-10）。13C-NMR 数据见表1，显示13 个碳信号，包括2个季碳，3 个次甲基，7 个亚甲基，1 个甲氧基，与化合物maritolide[18]对比1H-NMR，13C-NMR 数据基本一致，主要区别在于化合物2 少了一个连氧亚甲基信号，出现了一个甲氧基信号。HMBC 谱中OMe（δH3.65）与C-12（δC175.7）相关，进一步支持上述推测。为进一步判定C-4 位的绝对构型，我们对其比旋光度进行了测定，结果为[α]2D4+4.30（c 0.3，CHCl3），与原文献[α]2D4-3.4（c 0.2，CHCl3）相反，从而确定其绝对构型为4S。综上所述，化合物2 鉴定为methy（lS）-8-（5-oxo-2，5-dihydrofuran-2-yl）octanoate。

化合物3：淡黄色油状。MS m/z：187.1 [M+Na]+，分子式：C10H12O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.30（dq，J=16.3，6.9 Hz，1H，H-9），5.59 （d，J=16.3 Hz，1H，H-8），4.57（t，J=6.9 Hz，1H，H-3），3.79（t，J=5.6 Hz，2H，H-1），1.94（m，2H，H-2），1.72（d，J=6.9 Hz，3H，H-10）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物3 为gymnasterkoreayne A。

化合物4：无色油状。MS m/z：185.1 [M+Na]+，分子式：C10H10O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：4.57（td，J=6.1，5.8 Hz，1H，H-3），3.74（m，2H，H-1），1.97（s，3H，H-10），1.87（m，2H，H-2）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物4 为（S）-deca-4，6，8-triyne-1，3-diol。

化合物5：无色油状。MS m/z：245.1 [M+Na]+，分子式：C13H18O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.00（d，J=15.8 Hz，1H，H-7），6.44（d，J=15.8 Hz，1H，H-8），5.94（s，1H，H-4），2.62（d，J=17.1 Hz，1H，H-2a），2.31（s，3H，H-10），2.28（d，J=17.1 Hz，1H，H-2b），1.89（s，3H，H-13），1.06（s，3H，H-11），1.02（s，3H，H-12）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定化合物5 为dehydrovomifoliol。

化合物6：淡黄色油状。MS m/z：219.1 [M+Na]+，分子式：C11H16O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.76（s，1H，H-7），4.22（m，1H，H-3），2.42（dd，J= 13.5，2.6 Hz，1H，H-4a），1.99（dd，J=14.4，2.6 Hz，1H，H-2a），1.76（s，3H，H-10），1.74（dd，J=13.5，2.6 Hz，1H，H-4b），1.53（dd，J=14.4，2.6 Hz，1H，H-2b），1.47（s，3H，H-9），1.28（s，3H，H-11）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[20]报道基本一致，故鉴定化合物6为loliolide。

化合物7：无色油状。MS m/z：265.1 [M+Na]+，分子式：C13H22O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.18（d，J=15.8 Hz，1H，H-8），6.18（d，J=15.8 Hz，1H，H-7），3.76（m，1H，H-3），2.31（dd，J=14.3，9.2 Hz，1H，H-4a），2.29（s，3H，H-10），1.65（dd，J=14.3，9.2 Hz，1H，H-4b），1.58（m，1H，H-2a），1.27（m，1H，H-2b），1.19（s，3H，H-11），1.18 （s，3H，H-13），0.96 （s，3H，H-12）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定化合物7 为（3S，5R，6S，7E）3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物8：无色油状。MS m/z：231.1[M+Na]+，分子式：C13H20O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.89（s，1H，H-4），5.69 （dd，J=15.3，6.0 Hz，1H，H-8），5.58（dd，J=15.3，9.3 Hz，1H，H-7），4.28 （m，1H，H-9），2.66（d，J=9.3 Hz，1H，H-6），2.42（d，J=16.8 Hz，1H，H-2a），2.05（d，J=16.8 Hz，1H，H-2b），1.96（s，3H，H-13），1.24（d，J=6.5 Hz，3H，H-10），1.03（s，3H，H-11），0.96（s，3H，H-12）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[22]报道基本一致，故鉴定化合物8 为（6R，9R）-3-oxo-α-ionol。

化合物9：无色油状。MS m/z：209.1 [M+Na]+，分子式：C10H18O3。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.88（dd，J=17.3，10.8 Hz，1H，H-2），5.25（dd，J=17.3，1.8 Hz，1H，H-1a），5.04（dd，J=10.8，1.8 Hz，1H，H-1b），3.82（m，1H，H-4），3.83（dd，J=9.4，3.4 Hz，1H，H-6），2.22（ddd，J=14.0，9.4，5.5 Hz，1H，H-5a），1.87 （ddd，J=13.5，5.5，3.4 Hz，1H，H-5b），1.27（s，3H，H-8），1.24（s，3H，H-10），1.14（s，3H，H-9）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[23]报道基本一致，故鉴定化合物9 为trans-4-hydroxylinalool-3，6-oxide。

表1 化合物1-10 的13C-NMR 数据

化合物10：黄色油状。MS m/z：237.1 [M+Na]+，分子式：C12H22O3。1H-NMR（600 MHz，CDCl）3δ：5.86（ddd，J=16.9，10.4，6.3 Hz，1H，H-2），5.21 （dt，J=16.9，1.4 Hz，1H，H-1a），5.10（dt，J=10.4，1.4 Hz，1H，H-1b），4.09（m，1H，H-3），3.66（s，3H，H-12），2.30（t，J=7.5 Hz，2H，H-10），1.61（m，2H，H-9），1.52（m，2H，H-4），1.30（m，8H，H-5-H-8）。13C-NMR 数据见表1。以上数据与文献[24]报道基本一致，故鉴定化合物10为methy（lS）-9-hydroxy-10-undecenoate。

2.5 抗肝癌活性 本文对茵陈蒿中分离得到的化合物进行抗肝癌活性测试，以浓度为3 μM 的紫杉醇作为阳性对照，细胞毒活性如表2 所示，研究结果表明，在30 μM 浓度下，上述化合物对肝癌细胞株（HepG2）未显示出抑制活性。

表2 化合物1-10 对HepG2 的细胞毒活性

2.6 抗HBV 活性 本文对茵陈蒿中分离得到的烯炔类化合物（1，3，4）进行抗HBV 活性测试，以浓度为30 μM 的拉米夫定作为阳性对照，结果如表3 所示，研究结果表明，在30 μM 和100 μM 浓度下，化合物1，3，4 均未显示出抗HBV 活性。

表3 化合物1，3，4 在30 μM 和100 μM 浓度下抗HBV 活性

3 结论与讨论

肝病是我国高发病率的病种，常见的肝病有肝炎、肝纤维化、脂肪肝、肝癌等。基于前期文献调研显示，茵陈蒿是传统抗肝病中药茵陈的主要植物来源之一，临床上用于治疗各种肝胆疾病的复方方剂中均含有茵陈蒿，例如茵陈蒿汤可通过抑制JAK2/STAT3 信号通路促进肝癌细胞死亡，从而发挥抗肝癌作用[25]，茵陈蒿汤加味临床上可用于治疗慢性乙型肝炎[26]。但目前有关茵陈蒿中化学成分及其活性研究大多集中于有机酸类，黄酮类和香豆素类化合物[27]，针对萜类化合物的研究较少，且缺乏茵陈蒿中单体化合物对肝癌细胞增殖的研究报道。本文从茵陈蒿的95%乙醇提取物中，萜类化合物含量最多的流份里分离出10 个化合物，并对其化学结构进行鉴定，包括5 个萜类，3 个烯炔类，2 个脂肪酸类化合物，其中化合物1 和2 为新化合物。体外抗肝癌活性的实验结果表明，这些化合物对HepG2 细胞无显著抑制作用。此外，根据文献报道，茵陈蒿中烯炔类化合物具有一定抗HBV 活性[14]，本研究论文针对分离得到的烯炔类化合物1，3，4 进行抗HBV活性检测，结果表明这三个化合物均无抗HBV 活性。现代药理学研究表明，茵陈蒿汤还具有抗肝硬化，肝纤维化等活性[28]，后续将对分离得到的化合物进行抗肝病相关活性测试，并对活性化合物的作用机制进行解析，为其治疗肝病的药用价值提供科学依据和基础。本研究丰富了茵陈蒿的化学成分，并为其药理学研究奠定了物质基础。