基于PacBio16SrRNA基因全长测序调查某校园水体微生物群落结构及多样性研究

叶珏妃 张逸博 万晶 党晨原 付杰

关键词：微生物多样性；群落结构；水体；16S rRNA基因全长测序

前言

微生物是淡水系统中的重要组成部分，其种类众多且组成复杂，这种多样性使得环境中微生物群落的结构和代谢功能出现差异，进而对水生生态系统的功能产生不同的影响。同时微生物对其所处水生环境的变化十分敏感，能够反映出水环境的质量和水生态系统的稳定性。如今微生物研究广泛采用16S rRNA基因测序技术，特别是近年来，16S rRNA基因全长测序技术的应用，使得我们能够获得环境微生物群落的高分辨率结构（精确到种、甚至菌株）。

空气、土壤以及水体等是校园环境的重要组成部分，其环境状况会对人们的身心健康产生影响。近年来关于校园土壤环境的研究集中于重金属污染方面，空气环境研究则主要关注微生物污染，水环境方面的研究主要关于理化指标，如河流中的氮磷污染与富营养化、地表水中三氮的变化情况、雨水水质分析等，而关于校园水体环境中微生物组成以及理化指标对微生物群落结构影响的研究相对较少。

因此研究以武汉市洪山区某高校水体作为研究对象，该校园分布着多处水体，主要包括源湖、南一楼西湖和东湖、醉晚亭西湖和东湖、东九湖以及仍在修复恢复期的湖溪河等。通过PacBi0 16S rRNA基因全长测序的方法来调查该校园水体微生物的组成结构、丰度及多样性，以加深对校园淡水生态系统的了解，为校园水体的治理和改善等措施提供了数据基础与理论参考。

1材料与方法

1.1样本采集

根据《地表水与污水监测技术规范》（HJ/T 91-2002）进行布点和采样。水样采集于2021年9月7日，采样水体分别为源湖、南一楼湖西湖、南一楼湖东湖、醉晚亭西湖、醉晚亭东湖以及东九湖。现场采用便携式仪器测量水样的pH、溶解氧和温度，剩余水样保存于试剂瓶中运回实验室，部分样本用于检测化学需氧量、氨氮和总磷，剩余样本冷藏保存备用。

1.2DNA提取和PCR扩增

使用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒提取水样中的微生物群落基因组DNA。对微生物的16SrRNA基因的V1-V9区域进行PCR扩增，使用的引物为27F5-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3以及1492R5-RGYTACCTTGTTACGACTT-3。使用2%的琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences， UnionCity．CA，USA）进行回收产物纯化。

1.3文库构建和测序

使用Pacific Biosciences SMRTbellTM TemplatePrep kit1.0试剂盒对扩增子混合物进行操作以构建文库，并在PacBio SequelⅡ上进行测序。所有扩增子测序由上海凌恩生物科技有限公司完成。测序数据以登录号OEP003661（https：//www. biosi-no. org/node/index）保存在国家组学数据百科全书（NODE）中。

1.4文库构建和测序

使用SMRTLINK9.0分析软件处理PacBio下机数据，从而获得环形一致性CCS序列（circular con-sensus sequencing）。进行操作分类单元OUT（Oper-ational Taxonomic Unit）聚类分析与数据统计。使用Mothur1.35.1计算Chao丰富度指数和Shannon多样性指数，比较校园不同水体的微生物群落Alpha多样性的差异。分别选取各样本在门分类水平和属分类水平上丰度最高的20个物种数据绘制组分图。通过PCoA分析图探讨各水体微生物群落间的Beta多样性。采用冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）进一步探究分析环境因子对微生物群落结构的影响。

2结果与分析

2.1校园各水体的基本理化性质

实验检测了pH、温度、溶解氧（DO）、化学需氧量（COD）、氨氮（NH2-N）、总磷（TP）共6项理化指标，并且依据《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）对各水体进行地表水水质评价（如表1所示）。《地表水环境质量标准》中说明I类水主要适用于源头水；Ⅱ类主要适用于集中式生活饮用水地表水源地一级保护区；Ⅲ类主要适用于集中式生活饮用水地表水源地二级保护区；Ⅳ类主要适用于一般工业用水区及人体非直接接触的娱乐用水区；V类主要适用于农业用水区及一般景观要求水域。对比各项指标可知，源湖、南一楼西湖和东湖、醉晚亭西湖湖水质均为Ⅳ类水，醉晚亭东湖水质达到了Ⅲ类水的要求，而东九湖水质在V类水以下，不满足作为景观水体的要求。（见表1）

2.2校园水体微生物群落多样性与物种组成分析

计算了校园6处水体的Alpha多样性指数。南一楼西湖、南一楼东湖、源湖的Chao指数和Shannon指数均较高，Chao指数分别为3818.00、3750. 46、3932.00，Shannon指数为11.36、11.22和11.44。东九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭东湖的Chao指数（分别为1239. 18、2809. 18、1951. 28）和Shannon指数（分别为9.38、9.09、8.96）均低于上述3处水。以上数据表明，南一楼西湖、南一楼东湖和源湖微生物群落的丰富度和多样性都较高。而剩下的东九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭东湖这3处水体的群落丰富度和多样性则均较低。其中源湖的Chao指数和Shan-non指数最高，微生物群落的丰富度和多样性都是最高的。Chao指数数值最低的是东九湖，具有最低的物种丰度，群落多样性最低的水体是醉晚亭东湖，Shannon指数数值最小。

6个水体样本中共有40个菌门，其中在门分类水平上，相对丰度排名前10的菌门如图1（a）所示，变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacte-roidetes）和放线菌门（Actinobacteria）在6个水体样本中均为优势菌门。东九湖和源湖中Proteobacteria和Bacteroidetes的丰度总和均超过了70%。但醉晚亭东湖、南一楼西湖和东湖中其余菌门的丰度总和均接近50%，醉晚亭西湖中Proteobacteria和Bacte-roidetes的丰度总和仅为33.51%，其余菌门的占比达到了66.49%。其余高丰度菌门在各样本中的相对丰度也呈现出差异，蓝细菌门（Cyanobacteria）在醉晚亭西湖和东湖中的占比较高，分别为14.94%和15.90%，但在东九湖中仅为0.28%；其在南一楼西湖中的占比为11.94%，但在南一楼东湖中占比仅为5.78%。厚壁菌门（Firmicutes）在醉晚亭西湖中的占比为24.65%，但在源湖和醉晚亭东湖中占比较低，分别为1.2%和1.59%。醉晚亭西湖和东湖样本相对丰度排名前5的菌门中，共有的优势菌门包括Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria和浮霉菌门（Planctomycetes）；南一楼西湖和东湖样本相对丰度排名前5的菌门中，共有的高丰度优势菌门包括Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Planctomycetes。

6个水体样本中共含有727个菌属，如图1（b）所示为属分类水平上相对丰度排名前20的菌属。假单胞菌属（Pseudomonas）和分支杆菌属（Mycobacterium）为醉晚亭西湖和东湖、南一楼西湖和东湖样本中含量较高的菌属，Pseudomonas在4个样本中的相对丰度分别为4.81%、27.83%、8.91%和6.54%，Mycobacte-rium的占比则分别为5.11%、8.33%、7.89%和9.39%。醉晚亭西湖中含量最高的菌属为微小杆菌属（Exiguobacterium），其相对丰度达到了23.11%。黄杆菌属（Flavobacterium）在东九湖和源湖样本中的含量较高，分别为7.64%和12.54%。莱茵海默氏菌属（Pararheinheimera）在源湖中的含量较高，达到了8. 42%。硫酸曲菌属（Sulfuricurvum）在东九湖样本中的相对丰度较高，为9.87%。水体样本中相对丰度排名前20的菌属还包括利姆诺螺旋菌属（Limno-spira）、中间根瘤菌属（Mesorhizobium）、小梨形菌属（Pirellula）、诺德拉菌属（Nordella）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、茉莉亚菌属（Moorea）、几丁质单胞菌属（ Chitinimonas）、阿佐内克苏思菌属（Azonexus）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、新鞘氨醇菌（Novosphingobium）等。

2.3校园水体样本间Beta多样性分析

如图2所示水体样本的PCoA分析图，结果表明醉晚亭西湖和东湖、南一楼西湖和东湖微生物的群落组成较为相似，上述4个水体样本与东九湖、源湖样本微生物组成的差异性较大。这说明东九湖和源湖样本与其他4个水体样本的物种组成具有较大差异。并且在所有水体样本中，微生物群落结构最相似的水体样本是醉晚亭西湖和东湖。

采用冗余分析（RDA）探究环境因子对优势菌门相对丰度的作用，结果如图3所示。源湖的菌群结构受到环境因子NH3 -N、TP、pH的影响，南一楼西湖与醉晚亭东湖都主要受到pH、DO的影响，南一楼东湖受到环境因子COD、DO的影响，醉晚亭西湖受到COD、DO的影响，东九湖则主要受到NH3-N、TP、COD的影响。水体中的微生物群落结构受到多种环境因子不同程度的影响，其中NH3-N、TP、DO对水体产生了较大影响。

3讨论

水质理化指标评价结果显示源湖、南一楼西湖和东湖、醉晚亭西湖和东湖的水质均在Ⅳ类以上，只有东九湖水质在V类以下，各个水体的DO、COD、氨氮和总磷均具有一定差别。Alpha多样性指数分析结果显示，南一楼西湖、南一楼东湖和源湖微生物群落的丰富度和多样性均较高，东九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭东湖水体的群落丰富度和多样性则均较低。

6个水体的微生物群落组成相似，主要由Pro-teobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Cyanobacteria等组成，其中绝大多数菌门均属于Newton等人发现的21个典型淡水细菌门类。Proteobacteria、Bacte-roidetes和Actinobacteria的相对丰度均较高，现有研究发现这3个菌门均为湖泊生态系统中的优势菌门。Bacteroidetes和Proteobacteria则是富营养化淡水系统中高丰度的微生物群落，徐超等人检测到太湖蓝藻水华暴发期间的优势细菌门类为Cyanobacteria、Actinobacteria和Proteobacteria，寇文伯等人发现鄱阳湖表层水体的菌群主要隶属于Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。醉晚亭西湖和东湖以及南一楼西湖的Cyanobacteria的相对丰度均较高，但东九湖中的Cyanobacteria丰度仅为0.28%。这可能是水体中氨氮和总磷含量的差异所导致，醉晚亭西湖和东湖、南一楼西湖中的氨氮含量均低于0.7mg/L，总磷含量低于0. 04mg/L，Cyanobacteria已被证明能够在繁殖过程中消耗氮和磷，这表明醉晚亭西湖和东湖、南一楼西湖中的Cyanobacteria能够有效利用水体中的氮磷实现丰度的增加。

属分类水平上的分析结果显示不同水体样本中各菌属的相对丰度比例差异较大，部分菌属在某样本中优势明显，但在其余样本中相对丰度占比极低。Pseudomonas和Mycobacterium为醉晚亭西湖和东湖、南一楼西湖和东湖样本中含量较高的菌属，但Mycobacterium在东九湖中的占比仅为0.51%；东九湖和源湖样本中含量较高的菌属是Flavobacterium，但醉晚亭东湖和南一楼西湖中的Flavobacterium相对丰度都在1.00%以下。

PCoA图的分析结果表明醉晚亭西湖和东湖、南一楼西湖和东湖微生物的群落组成较为相似，上述4个水体样本与东九湖、源湖样本微生物组成的差异性较大。RDA分析表明水体的微生物群落结构和多样性受到NH3 -N、TP、pH、COD、DO等环境因子的影响，其中NH3-N、TP、DO对校园水体的微生物群落产生了较大影响。

4结论

该校园中的源湖、南一楼西湖和东湖、醉晚亭西湖和东湖的水质均在Ⅳ类以上，东九湖水质在V类以下，80%的水体达到了《地表水环境质量标准》中一般景观水体的要求。不同水体微生物群落的结构和多样性具有显著差异，源湖、南一楼西湖和东湖的群落丰富度和多样性均较高，东九湖、醉晚亭西湖和东湖水体则较低。具体表现为水体的菌门和菌属的组成与丰度有所不同，呈现出复杂的变化情况。Be-to多样性分析结果显示空间距离小的水体的群落组成具有更大的相似性，醉晚亭西湖和东湖、南一楼西湖和东湖的组成相似，东九湖与源湖与上述水体群落结构差异较大。水体群落多样性受外界环境因素影响，总体上主要受到环境因子NH3-N、TP、DO的影响。