一株中度嗜盐在极端条件下絮凝性质的研究

兴虹 王特 吴丽红 安长伟

关键词：微生物絮凝剂；四氢嘧啶；絮凝活性；高盐制药废水

前言

微生物絮凝剂与人工合成的化学絮凝剂相比具有无毒、易生物降解、无二次污染的特点，在污水净化处理领域显示了较大的应用价值。但是，微生物絮凝剂会因为高盐、高温或低温、极端pH、高浓度重金属等不利因素而显著降低絮凝活性，在诸如石油和天然气生产、海水冷却、皮革加工、制药等行业废水过程处理应用中絮凝效率低下。提高微生物絮凝剂在极端环境下的絮凝活性的研究受到关注。

某些中度嗜盐菌（如盐单胞菌）能够应答环境某些因素（如高渗透压）的胁迫合成渗透压补偿溶质四氢嘧啶（1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrim-idinecar-boxylic acid）。四氢嘧啶能够减轻热胁迫、冷冻、干燥、高盐、氧自由基、辐射、尿素和其他变性剂对蛋白质、核酸、生物膜、甚至整个细胞的有害影响，对生物大分子及整个细胞具有抗逆保护作用。据报道四氢嘧啶分泌型的盐单胞菌（Halomonas salina）在特定的条件下能够合成并分泌四氢嘧啶，分泌至细胞外的四氢嘧啶将会对胞外大分子物质（如多糖，蛋白质等）具有抗逆保护作用。据此，文章拟筛选具有絮凝活性的四氢嘧啶分泌型菌株；考察该菌株微生物絮凝剂在30g/L NaCl的高岭土悬浮液体系中的絮凝性质；探讨添加四氢嘧啶对该菌株微生物絮凝剂的抗逆保护作用；在此基础上，考察该菌株微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成（在一个发酵过程中同时合成微生物絮凝剂和四氢嘧啶）发酵液在高盐制药废水的固形物含量、色度和浊度的絮凝处理效果。

1实验材料与方法

菌株分离样品：采自某制药厂污水处理池底泥。

发酵方法：菌株B01经活化后．按1%接菌量转接至培养基（30/300mL）中，30℃，120r/min培养72h。

絮凝活性测定方法：参照文献[7]的分光光度计法。悬浮液：100mL0.4%（w/v）高岭土悬浮液，NaCl浓度30g/L。用721型分光光度计在波长550nm处测定吸光值，计算絮凝率。絮凝活性用絮凝率来表示。F=（A-B）x100%，其中F为絮凝率；A对照的吸光度值；B为加入絮凝剂的吸光度值。

Ectoine浓度测定方法：参照文献[8]的高效液相色谱方法。

浊度测定方法：参照国家标准（BG13200-91）的分光光度法。

色度测定方法：参照国家标准（BG11903-89）的铂钴比色法。

2实验结果与讨论

2.1微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成菌株筛选鉴定

从某制药厂污水处理池底泥中分离筛选微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成菌株。菌株分离样品按重复划线法分离直至获得纯化的单菌落，挑选20个单菌落，培养菌株并进行发酵。发酵液在4℃，15000×g条件下离心15min，取发酵上清液测定絮凝活性及四氢嘧啶浓度。其中菌株HDM-081发酵上清液的絮凝活性和四氢嘧啶浓度最高，分别为39.7%和835.6mg/L。该菌株经16SrDNA分析鉴定为Halomonas菌，命名为Halomonassp. strain HDM-081。Halomonassp. strain HDM-081台旨够在一个发酵过程中同时合成微生物絮凝剂和四氢嘧啶，二者均部分分泌至发酵液中。

2.2Halomonassp.strain HDM-081微生物絮凝剂的合成条件优化

从Halomonassp. strain HDM-081发酵液中提取纯化微生物絮凝剂，在考察的多种提取方法中，按文献[3]提取产物的絮凝活性最高，以下絮凝剂的提取制备均按此方法进行。考察培养基的碳源种类和浓度、氮源种类和浓度、pH和NaCl浓度对Halomonassp.strain HDM-081发酵合成微生物絮凝剂的影响，结果如图1所示。将碳源分别设置为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乙酸钠和柠檬酸钠（以40g/L葡萄糖碳素浓度计），当以葡萄糖作为碳源时，微生物絮凝剂合成量最高，为7.8g/L（图1（a）），后续实验使用葡萄糖作为碳源。调整葡萄糖浓度分别为20g/L、40g/L、60g/L和80g/L，当葡萄糖浓度为60g/L时，微生物絮凝剂合成量最高，为9.1g/L（图1（b）），优化的葡萄糖浓度为60g/L。相同方法优化氮源种类及其浓度，图1（c）结果显示，在氯化铵、硝酸铵、硫酸铵和硝酸钾四种氮源中，硫酸铵作为氮源时微生物絮凝剂合成量最高，为9.1g/L；图1（d）结果显示，硫酸铵浓度为12.5g/L时，微生物絮凝剂合成量最高，为10.4g/L。优化的氮源是硫酸铵，优化氮源浓度为12.5g/L。将培养基初始pH分别设置为5、6、7、8和9，当pH为7时，微生物絮凝剂合成量最高，为10.4g/L。优化的培养基初始pH为7。在上述优化好的条件下，设置培养基的NaCl浓度分别为30、60、90和120g/L，在NaCl浓度为60 g/L时，微生物絮凝剂合成量最高，为10.4g/L。综上所述，Halomonassp. strain HDM-081合成微生物絮凝剂的优化发酵条件为：60g/L葡萄糖为培养基碳源，12.5g/L硫酸铵为培养基氮源，培养基初始pH为7，培养基NaCl浓度为60g/L。在此优化条件下，Halomonassp. strain HDM-081发酵培养72h合成微生物絮凝剂量为10.4g/L。

2.3Halomonassp.strain HDM-081微生物絮凝剂的絮凝性质

测定絮凝剂在不同NaCl浓度、不同温度、不同pH下的絮凝活性，絮凝剂添加量为0.8g/L，结果如图2所示。将絮凝活性测定体系的温度调整为10，20，25，30，35，40．45，50和60℃条件下，30℃～35℃时絮凝活性较高，分别为61.6%，65.3%和58.9%，当温度降低至10℃时絮凝活性为28.1%，当温度增加至60℃时絮凝活性为24.3%。最适温度为35℃（见图2（a》。将絮凝活性测定体系的pH调整为5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5和9条件下，pH7-8时絮凝活性较高，分别为65.3%，69.3%和64.2%。最适pH为7.5（见图2（b））。将絮凝活性测定体系的NaCl浓度调整为0，15，30，45，60，75和90g/L条件下，NaCl浓度在0，15，30和45g/L时絮凝活性最高，分别为69.3%，70.4%，70.5%和68.4%，当NaCl浓度增加至90g/L时絮凝活性为50.7%（为最高絮凝活性的72.1%）（见图2（c））。该菌株在一定盐浓度下具有最高絮凝活性，而且高浓度盐对其影响较小。表明B01菌株的絮凝剂为耐盐性絮凝剂。Halomonas sp.strain HDM-081微生物絮凝剂絮凝活性最高的条件是温度为35℃，pH为7.5，NaCl浓度为30g/L。

2.4四氢嘧啶对微生物絮凝剂的抗逆保护作用

为了考察四氢嘧啶对微生物絮凝剂的抗逆保护作用，在极端条件下的絮凝活性测定体系中添加四氢嘧啶，提取纯化微生物絮凝剂和四氢嘧啶的添加量分别为0.8g/L和400mg/L。极端条件下未添加及添加四氢嘧啶的微生物絮凝剂的絮凝活性如图3所示。在100C的低温条件下，絮凝活性由28.1%提高到56.2%，提高了99.8%。在60℃的高温条件下，絮凝活性由21.3%提高到64.2%，提高了201.5%。在pH为5的酸性条件下，絮凝活性由32.5%提高到63%，提高了93.8%。在pH为9的碱性条件下，絮凝活性由49%提高到69.8%，提高了42.5%。在NaCl为90g/L的高盐条件下，絮凝活性由50.7%提高到74.1%，提高了46.1%。上述实验表明，四氢嘧啶对微生物絮凝剂具有较显著的抗逆保护作用。低温、高温、酸性、碱性和高盐等不利条件会导致微生物絮凝剂大分子空间构型的变化，因而造成絮凝活性的降低。在微生物絮凝剂中添加四氢嘧啶，会提高微生物絮凝剂大分子在逆环境中的结构稳定性，从而提高絮凝活性。

2.5微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成发酵液净化处理高盐制药废水

高盐高氨氮制药废水是目前极难处理的废水之一。其特点是废水中盐浓度和氨氮浓度高、废水成分复杂、有机污染物种类多、有毒有害物质多且有较强的生物抑制性。文章对某制药厂产生的高盐制药废水（Cl-浓度45.8g/L）进行了净化处理。在高盐制药废水中添加微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成发酵液（添加量为2.5%，微生物絮凝剂浓度为0.3g/L，四氢嘧啶浓度为20.9mg/L），测定固形物含量、色度和浊度，结果如表1所示。由表1可见，固形物含量、浊度、色度的去除率分别为87.9%、77.8%和88.6%。林俊岳[10]等人研究H6菌能利用高盐合成废水生长微生物絮凝剂，但在0.5%～6%的盐浓度范围内，随发酵时间的延长，发酵液的絮凝能力均有所下降，絮凝率最高下降65.1%。研究使用的Halomonas sp.HDM - 081可以在高盐（60g/L NaCl）下快速生长（如图1（f）所示）并合成具有耐盐性的微生物絮凝剂（图2（c）），而四氢嘧啶的抗逆协助作用又使微生物絮凝剂的耐盐性进一步得到提升。因此Halomonas sp.HDM-081微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成发酵液对高盐制药废水净化处理效果显著。

3结论

文章从污水池底泥中分离筛选的中度嗜盐菌Halomonas sp. strain HDM-081，能够在一个发酵过程中同时合成微生物絮凝剂和四氢嘧啶。合成微生物絮凝剂的优化发酵条件为：60g/L葡萄糖为培养基碳源，12.5g/L硫酸铵为培养基氮源，培养基pH为7，培养基NaCl浓度为60g/L。在此优化条件下，发酵培养72h合成微生物絮凝剂10.4g/L。微生物絮凝剂絮凝活性最高的条件为：35℃，pH为7.5，NaCl浓度为30g/L。四氢嘧啶对提取纯化的微生物絮凝剂在低温高温、酸性碱性和高盐环境下具有显著的抗逆保护作用。用微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成发酵液净化处理高盐制荮废水，固形物含量、色度、浊度的去除率分别为87.9%、77.8%、88.6%。Halomonas sp. strain HDM-081微生物絮凝剂／四氢嘧啶共合成发酵液对高盐制药废水净化处理效果显著。