高咬合状态下牙龈组织中VEGF及β-catenin表达的变化及其机制

李妍 刘晔 李婷婷 宗斌 高鹏玉 徐全臣

［摘要］ 目的 通過检测高咬合状态下小鼠牙龈组织中血管内皮细胞生长因子（VEGF）及β-catenin表达的变化，探讨VEGF及Wnt/β-catenin信号通路在牙龈组织改建中的作用。方法 选取4周龄昆明种雄性小鼠30只，随机分为对照组和实验组，每组15只小鼠。通过拔除小鼠右侧上颌全部磨牙的方法建立实验组小鼠高咬合模型。分别于术后第3、7、14、28、56天，每组每次随机选取3只小鼠麻醉后处死，分离左侧下颌第一磨牙及牙龈组织，使用苏木精-伊红（HE）染色观察牙龈组织结构的变化，使用免疫组化染色方法检测牙龈组织中VEGF以及β-catenin表达的变化。结果 HE染色显示，实验组拔牙后第14天牙龈组织明显增厚，血管数量增多。免疫组化检测结果显示，对照组不同时间点牙龈组织中VEGF、β-catenin表达比较，差异无显著性（P＞0.05）。实验组不同时间点牙龈组织中VEGF、β-catenin表达比较，差异有显著性（F=250.4、343.9，P＜0.01）。除拔牙后第56天外，两组其余时点牙龈组织VEGF、β-catenin表达比较差异均有显著性（F=5.7～38.4，P＜0.05）。结论 高咬合状态下，牙龈组织中VEGF及β-catenin表达的变化影响牙龈组织的改建。

［关键词］ 咬合力；牙龈；血管内皮生长因子类；Wnt信号通路；β连环素；模型，动物；小鼠

［中图分类号］ R781.4；R322.41    ［文献标志码］ A

［ABSTRACT］ Objective To investigate the role of vascular endothelial growth factor （VEGF） and the Wnt/β-catenin signaling pathway in gingival tissues remodeling by measuring the changes in VEGF and β-catenin expression in mouse gingival tissues under hyperocclusion.  Methods Thirty male Kunming mice aged four weeks were randomly divided into control group （n=15） and experimental group （n=15）. All the right maxillary molars of mice in the experimental group were extracted to establish a hyperocclusion model. On the 3rd， 7th， 14th， 28th， and 56th days after operation， three mice in each group were randomly selected and sacrificed under anesthesia. Their left mandibular first molars with the gingival tissues were isolated. Hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to observe the histological changes of the gingiva， and immunohistochemical staining was used to measure the changes in VEGF and β-catenin expression in the gingival tissues.  Results The HE staining showed that in the experimental group， the thickness of gingival tissues and the number of blood vessels increased on day 14 after tooth extraction. The results of immunohistochemical examination showed that in the control group， there were no significant differences in the expression of VEGF and β-catenin in the gingival tissues between different time points （P>0.05）; while in the experimental group， there were significant differences in that between different time points （F=250.4，343.9，P<0.01）. At all time points except the 56th day after tooth extraction， there were significant differences in the expression of VEGF and β-catenin in the gingival tissues between the two groups （F=5.7-38.4，P<0.05）.  Conclusion Under hyperocclusion， changes in the expression of VEGF and β-catenin in gingival tissues affect the remodeling of gingival tissues.

［KEY WORDS］ Bite force; Gingiva; Vascular endothelial growth factors; Wnt signaling pathway; beta catenin; Models， animal; Mice

咬合力是维持牙周内环境稳态的主要因素，对牙周膜（PDL）的发育、成熟、形态和功能的维持以及牙槽骨的改建等起重要作用[1-2]。然而，临床上也常常观察到导致咬合力异常增高的情况，如牙齿早接触、磨牙症等。咬合力异常对PDL和牙槽骨的影响已有大量报道[3-6]，但是对牙龈组织改建的影响却鲜有研究。血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种重要的促血管生成因子，其表达与咬合力的刺激密切相关[7-8]。研究证实VEGF在机械力刺激的牙周组织改建中起重要作用[9]。Wnt/β-catenin信号通路是一条高度保守的信号通路，对于维持牙周组织内环境稳态有重要意义[10-12]。我们在前期研究中发现，咬合力的改变可以引发PDL以及牙槽骨的一系列适应性改建，而Wnt/β-catenin信号通路在这一过程中发挥着重要的调节作用[13-14]。本研究通过建立小鼠高咬合模型，观察高咬合状态下小鼠牙龈组织中VEGF和β-catenin表达的变化情况，并进一步探讨Wnt/β-catenin信号通路在小鼠牙龈组织改建中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及设备

DAB显色试剂盒、SABC试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人EBNA-1单克隆抗体以及兔抗人EBNA-2单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），光学倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 实验分组以及动物模型的建立

4周龄雄性昆明种小鼠（购买自青岛大学动物实验室）30只，体质量（25±5）g，无龋坏，无牙周组织疾病，牙列完整。所有动物均常规饲养于青岛大学动物实验室内，保持室温25 ℃，室内湿度56%，12-12 h明暗交替环境，标准饮食，自由饮水。将小鼠随机分为对照组和实验组，每组15只小鼠。小鼠适应性喂养1周后，麻醉状态下拔除实验组小鼠右侧上颌3颗磨牙。对照组仅进行麻醉处理。

1.3 标本制备

分别于拔牙后第3、7、14、28、56天，每组每次随机选取3只小鼠麻醉下处死小鼠。以40 g/L多聚甲醛行心脏灌注固定。取出左側下颌骨磨牙区骨段（含牙龈组织），浸泡于40 g/L多聚甲醛缓冲液中，于4 ℃环境中加强固定24 h；然后将标本移至EDTA中脱钙3～4周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，沿左侧下颌第一磨牙近远中方向连续5 μm厚切片，切片行苏木精-伊红（HE）染色及免疫组织化学染色。

1.4 HE染色

牙龈组织切片行常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，切片置于苏木精中染色5 min，氨水中返蓝30 s，然后置于伊红溶液中染色2 min；随后切片行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片，将切片置于显微镜下观察。

1.5 免疫组织化学染色检测牙龈组织中VEGF及β-catenin的表达

牙龈组织切片行常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，室温下将稀释的一抗滴加到切片上，孵育12 h。用含卵白蛋白的PBS稀释二抗，滴加到切片上，在室温下孵育30 min。将切片置于DAB溶液中孵育1～5 min，然后苏木精复染，中性树胶封片。于显微镜下观察下颌第一磨牙舌侧牙龈结缔组织，以细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒定义为阳性细胞。光镜下，每张切片随机选取3个高倍视野（1 000倍），计数视野内阳性细胞总数，并计算阳性细胞表达率。阳性细胞表达率=阳性细胞总数／细胞总数。

1.6 统计学分析

使用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件包处理数据，阳性细胞率以±s表示，组间比较采用重复测量设计的方差分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 高咬合状态对牙龈组织形态学的影响

HE染色结果显示，拔牙后第14 天实验组小鼠牙龈组织较对照组明显增厚，血管数量增多（图1）。

2.2 高咬合状态对牙龈组织中VEGF表达的影响

时间、组别、时间与组别交互作用对两组牙龈组织VEGF表达有明显的影响（F时间 =184.8，F组别 =844.7，F交互 =188.2，P＜0.01）。对照组不同时间点牙龈组织VEGF阳性表达率相比较差异无显著性（P＞0.05）。实验组不同时间点牙龈组织VEGF阳性表达率比较差异有显著性（F=250.4，P＜0.01）。除拔牙后第56天外，两组其余时点牙龈组织VEGF阳性表达率比较差异均具有显著性（F=5.7～20.8，P＜0.05）。见图2A～F、表1。

2.3 高咬合状态对牙龈组织中Wnt/β-catenin信号通路的影响

时间、组别、时间与组别交互作用对两组牙龈组织β-catenin的阳性表达率具有明显的影响（F时间=204.4，F组别=379.7，F交互=206.0，P＜0.01）。对照组不同时间点牙龈组织β-catenin阳性表达率比较差异无显著意义（P＞0.05）。实验组不同时间点牙龈组织β-catenin阳性表达率比较差异具有显著意义（F=343.9，P＜0.01）。除拔牙后第56天，两组其余时间点牙龈组织β-catenin阳性表达率均差异显著（F=5.9～38.4，P＜0.05）。见图2G～L、表2。

3 讨  论

3.1 高咬合状态对牙龈组织中VEGF表达的影响

在牙周组织中，VEGF主要表达于血管内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞以及成纤维细胞的细胞质中，参与牙周组织的改建与修复。VEGF是主要的血管生成因子，能够以自分泌因子的形式，作用于血管内皮细胞，促进新生血管的形成；同时，VEGF也能够以旁分泌因子的形式，作用于成骨细胞、破骨细胞以及成纤维细胞，增强细胞活性，促进细胞的增殖和分化，从而生成新生骨组织及胶原纤维[15-19]。研究发现，在正畸牙移动过程中，受压的PDL细胞能够产生VEGF，促进血管生成，同时，在骨吸收陷窝的破骨细胞中也可观察到VEGF的表达，VEGF通过调节局部血液循环和骨代谢来促进PDL内在平衡，在牙周改建中发挥关键作用[20]。通过构建咬合功能恢复的动物模型，MOTOKAWA等[21]发现咬合刺激可调节PDL细胞中VEGF的表达，从而诱导破骨细胞增殖，导致牙槽骨吸收。本研究在牙龈组织中也发现了类似的改变，高咬合状态下，牙龈组织中的VEGF表达增加，从而促进了血管生成，建立了有效的血液循环，为牙龈改建提供充足的营养物质。VEGF的增加意味着血管及组织的新生，这与本研究观察到牙龈组织的增厚相一致。本研究实验组VEGF的表达在拔牙后第14天时达峰值，然后逐渐下降，第56天时与对照组比较无明显差异，提示在高咬合状态作用下，牙龈组织通过一系列的改建作用，最终适应了高咬合状态，达到了新的生理平衡。

3.2 高咬合狀态对牙龈组织中Wnt/β-catenin信号通路的影响

Wnt/β-catenin信号通路可以通过介导机械信号转导调节细胞的增殖和分化，对维持PDL和牙槽骨稳态具有重要意义[22-26]。研究发现，经典的Wnt通路能够介导PDL细胞中的压力信号转导，通过其下游靶点调控成骨分化，并在体外通过平衡成骨细胞核因子κB受体活化受体和骨保护素的表达参与破骨形成[27]。牙龈成纤维细胞是牙龈组织中的主要应力细胞，静压力通过影响牙龈成纤维细胞中的糖原合成酶激酶-3β/β-catenin信号轴与α-平滑肌肌动蛋白的表达，将机械信号转变为生物信号，引发一系列生理活动，从而参与牙龈组织的改建过程[28]。在本研究中，高咬合状态下，牙龈组织中β-catenin表达增加，并持续升高至拔牙后第14天，然后下降。这一结果与本课题组之前在PDL中观察到的结果相一致[13]。提示高咬合状态可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路来影响牙龈组织的改建。

3.3 Wnt／β-catenin信号通路对牙周组织改建影响

本课题组前期的研究观察到，在高咬合状态下，PDL和牙槽骨初期表现为组织的破坏和细胞的凋亡，然而随着时间推移，组织的修复和细胞的增殖显示优势，最终呈现为PDL纤维增粗、排列致密和牙槽骨密度的增加，这些结果提示牙周组织通过改建来适应高咬合状态。课题组进一步利用转基因小鼠体内细胞系追踪技术，证明了Wnt/β-catenin信号通路对PDL和牙槽骨中的一系列组织和细胞学的改变起调控作用[13]。本实验中，高咬合状态的刺激引发牙龈组织中β-catenin和VEGF的表达增强，两者都呈现出先升高后降低的变化趋势，提示在牙龈组织中，增强的咬合力可能同样通过Wnt/β-catenin信号通路调控VEGF的表达，从而影响牙龈组织的改建，以适应新的咬合状态，维护牙周组织的健康。这一研究结果与其他学者所报道的Wnt/β-catenin信号通路在VEGF表达和血管生成过程中发挥重要作用的结论相一致[29-30]。

综上所述，高咬合状态可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节牙龈组织中VEGF的表达，影响牙龈组织的改建，具体机制尚待进一步研究。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准（文件号QYFYWZLL-26090）。所有实验过程均遵照《实验动物管理条例》进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

作者声明：李妍、刘晔、徐全臣参与了研究设计；李妍、刘晔、李婷婷、宗斌、高鹏玉、徐全臣参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。

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（本文編辑 耿波 厉建强）