CMS121对氧糖剥夺再灌注神经元及缺血再灌注模型小鼠脑神经损伤的保护作用及其机制

赵志远 赵睿 刘文豪 孙成建 徐锐

［摘要］ 目的 研究CMS121對氧糖剥夺再灌注（OGD/R）神经元及缺血再灌注（I/R）模型小鼠脑神经损伤的保护作用及其机制。方法 将皮质神经元分为对照组、OGD/R组和OGD/R+CMS121组，分别进行正常培养、OGD/R处理和OGD/R+CMS121治疗处理。24 h后，检测3组神经元的细胞活力和乳酸脱氢酶（LDH）释放水平。通过蛋白免疫印迹实验分析3组神经元再灌注6、24 h蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）的表达。将C57BL/6J小鼠随机分为Sham组、I/R组和I/R+CMS121组，分别进行假手术、I/R模型构建和I/R模型构建+CMS121处理，再灌注24 h后，通过神经严重度评分（NSS）评估小鼠神经系统受损情况，通过TTC染色计算小鼠的脑梗死体积占全脑体积的比例。结果 3组神经元的细胞活力和LDH释放水平比较差异有显著性（F=71.21、88.93，P＜0.01）；与OGD/R组相比，OGD/R+CMS121组的神经元细胞活力升高，LDH释放水平下降（t=5.56，11.63，P＜0.05）。时间、分组、时间与分组交互作用对神经元p-Akt表达有明显影响（F=13.48～32.67，P＜0.01），对Akt的表达均无影响（P＞0.05）。再灌注6 h，3组神经元p-Akt表达比较差异均有显著性（F=18.78，P＜0.01），与对照组比较，OGD/R组和OGD/R+CMS121组神经元p-Akt表达均升高（P＜0.01），且后两组间比较差异无显著性（P＞0.05）；再灌注24 h，3组神经元p-Akt表达差异有显著性（F=38.50，P＜0.01），OGD/R+CMS121组神经元p-Akt表达较对照组和OGD/R组相比均升高（P＜0.01），而OGD/R组和对照组间比较差异无显著性（P＞0.05）。3组小鼠NSS和脑梗死体积占全脑体积比例比较差异有显著性（F=20.24、118.60，P＜0.01）；与I/R组相比，I/R+CMS121组小鼠NSS降低，脑梗死体积减小（P＜0.05）。结论 CMS121对OGD/R处理的神经元和I/R模型小鼠的脑神经损伤有保护作用，这种保护作用可能是通过上调大脑皮质神经元Akt磷酸化水平实现的。

［关键词］ 颅神经损伤；细胞低氧；葡萄糖；再灌注损伤；神经元；神经保护；小鼠，近交C57BL

［中图分类号］ R745.1；R338    ［文献标志码］ A

［ABSTRACT］ Objective  To investigate the neuroprotective effects and mechanism of CMS121 in a neuron model of oxygen-glucose deprivation/reperfusion （OGD/R） and a mouse model of ischemia/reperfusion （I/R）.  Methods Cortical neurons were divided into control group （normal culture）， OGD/R group （OGD/R model construction）， and OGD/R+CMS121 group （OGD/R model construction plus treatment with CMS121）. All neurons viability and lactate dehydrogenase （LDH） release were assessed after 24 h of reperfusion. Western blotting was performed to measure the expression of protein kinase B （Akt） and phosphorylated Akt （p-Akt） in the neurons after 6 and 24 h of reperfusion. C57BL/6J mice were randomly divided into sham group （sham operation）， I/R group （I/R model construction）， and I/R+CMS121 group （I/R model construction plus treatment with CMS121）. After 24 h of reperfusion， we assessed the neurological damage of the mice with the Neurological Severity Score （NSS）， and calculated the brain infarct volume （as a percent of total brain volume） after 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride staining. Results There were significant differences in cell viability and LDH release between the three neuron groups （F=71.21，88.93，P<0.01）. Compared with the OGD/R group， the OGD/R+CMS121 group showed significantly increased neuronal viability and significantly reduced LDH release （t=5.56，11.63，P<0.05）. Time， group， and time × group interaction significantly affected neuronal p-Akt expression （F=13.48-32.67，P<0.01）， and showed no significant effects on Akt expression （P>0.05）. After 6 h reperfusion， a significant difference was observed in neuronal p-Akt expression between the three neuron groups （F=18.78，P<0.01）. Neuronal p-Akt expression was significantly increased in the OGD/R and OGD/R+CMS121 groups than in the control group （P<0.01）， and showed no significant difference between the OGD/R and OGD/R+CMS121 groups （P>0.05）. After 24 h reperfusion， p-Akt expression differed significantly between the three neuron groups （F=38.50，P<0.01）. The expression of p-Akt was significantly increased in the OGD/R+CMS121 group than in the control and OGD/R groups （P<0.01）， and showed no significant difference between the OGD/R and control groups （P>0.05）. There were significant differences in the NSS score and infarct volume between the three mouse groups （F=20.24，118.60，P<0.01）. Compared with the I/R group， the I/R+CMS121 group had a significantly decreased NSS score and a significantly reduced infarct volume （P<0.05）. Conclusion CMS121 has neuroprotective effects in the neuronal OGD/R model and mouse I/R model， possibly through upregulating Akt phosphorylation in cortical neurons.

［KEY WORDS］ Cranial nerve injuries; Cell hypoxia; Glucose; Reperfusion injury; Neurons; Neuroprotection; Mice， inbred C57BL

缺血再灌注（I/R）脑损伤在中老年人群中具有发病率及致残性高等特点[1-3] ，其发病机制复杂，其中炎症反应会加重I/R脑损伤[4]。近年来，乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）被发现参与炎症反应过程，抑制ACC1能够抑制I/R脑损伤的神经炎症，从而减轻I/R脑损伤[5]。CMS121是近年来发现的ACC1抑制剂[6-7]，在神经退行性疾病，特别是在阿尔茨海默症（Alzheimers disease，AD）细胞模型以及动物模型中，能够通过维持线粒体的稳态、调节脂质代谢水平、减少炎症以及脂质过氧化等发挥神经保护作用[8-9]。然而，CMS121是否能够作用于神经元并对I/R脑损伤产生影响，目前尚无文献报道。本研究旨在探索CMS121是否对I/R脑损伤神经元具有保护作用，并进一步探讨其作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料

雄性C57BL/6J小鼠共33只，4～6周龄，体质量20～25 g，购自于济南朋悦实验动物繁殖公司；CMS121购自美国MCE公司；Neurobasal培养基、B-27补充剂和L-谷氨酰胺购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8購自美国Targetmol公司；乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天公司；一抗抗蛋白激酶B（Akt）、抗磷酸化Akt（p-Akt）、Anti-β-actin和二抗羊抗兔购自武汉Abclonal公司；ECL发光液购自大连美仑生物技术有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、组织细胞固定液购自北京索莱宝公司。皮质神经元获赠于青岛大学神经再生与康复研究院。

1.2 体外实验

1.2.1 皮质神经元分组及处理 使用神经元的专用培养基（Neurobasal培养基、含体积分数0.02的B-27补充剂和0.5 μmol/L的L-谷氨酰胺）重新悬浮皮质神经元，将神经元分为对照组、氧糖剥夺再灌注（OGD/R）组和OGD/R+CMS121组，每组均按照2×108个/L和1×109个/L的密度分别接种于涂有多聚赖氨酸的96孔板和6孔板内，另设1组样品最大酶活性对照组，将细胞以2×108个/L密度接种于涂有多聚赖氨酸的96孔板内，将孔板置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温培养箱中静置培养。培养期间每3 d更换一次神经元专用培养基[10]。培养7 d后，对照组和最大酶活性对照组神经元不作其他处理，OGD/R组神经元进行常规OGD/R处理。OGD/R方法如下：一定质量的不同盐溶于去离子水当中，制备为脱氧无葡萄糖的细胞外溶液（具体的配方：NaCl 116 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgSO4 0.8 mmol/L，NaH2PO4 1.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaHCO3 26 mmol/L），经0.22 μm的过滤器进行无菌处理。使用脱氧无葡萄糖的细胞外溶液替换孔板中的神经元专用培养基，并将孔板放置于含体积分数0.95 N2和含体积分数0.05 CO2的专用室在37 ℃的条件下培养90 min；90 min后将脱氧无葡萄糖的细胞外溶液更换为神经元专用培养基[11]。OGD/R+CMS121组神经元同样进行OGD处理，并于再灌注时向孔板之中加入20 nmol/L的CMS121[6]。将孔板轻轻摇匀后，静置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温培养箱中继续培养。

1.2.2 细胞活力检测 对1.2.1中继续培养24 h的96孔板中的3组神经元进行细胞活力检测，具体方法如下：CCK8和神经元专用培养基按照1∶9的体积比配置为CCK8工作液。将96孔板中的神经元专用培养基更换为100 μL的CCK8工作液，另在未种植神经元的96孔中加入等量的CCK8工作液设为空白组，置于恒温培养箱中孵育4～6 h。使用酶标仪测量各组溶液在波长450 nm处吸光度（A）值，细胞活力（%）=（处理组A-空白组A）/（对照组A-空白组A）×100%，以此计算细胞活力。实验重复3次，结果取均值。

1.2.3 细胞LDH释放检测 对1.2.1中继续培养24 h的96孔板中的3组神经元进行细胞LDH释放检测。按照LDH细胞毒性检测试剂盒说明书的要求，向1.2.1中样品最大酶活性对照组神经元孔板中加入10 μL的LDH释放试剂孵育1 h，随后向4组神经元各孔中加入LDH检测工作液60 μL。使用酶标仪测量各组溶液在波长490 nm处吸光度（A）值，并计算LDH释放量。LDH释放量（%）=（处理组A-对照组A）/（细胞最大酶活性A-对照组A）×100%。实验重复3次，结果取均值。

1.2.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）实验检测3组神经元再灌注不同时间Akt、p-Akt的表达水平1.2.1中3组6孔板中神经元再继续培养6、24 h时，分别使用RIPA裂解液冰上裂解30 min，离心后吸取上清液，并置于100 ℃ 干式恒温器中再孵育15 min，制备为蛋白样品。通过SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离，在300 mA、60 min的条件下将蛋白转移到PVDF膜上。使用质量分数0.05的牛奶封闭液封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育2 h。使用ECL发光液在化学发光检测系统下进行显影。使用Image J软件分析蛋白的灰度值，并测定3组再灌注6、24 h后的Akt和p-Akt的表达水平。实验重复3次，结果取均值。

1.3 动物模型实验

1.3.1 分组及处理 将小鼠随机分为Sham组、I/R组和I/R+CMS121组。I/R组和I/R+CMS121组小鼠均使用线栓进行局灶脑I/R模型的构建[11]。本实验共使用33只小鼠，实验过程中1只小鼠死亡。采用Zea Longa评分评估小鼠神经功能缺损情况以确定模型制备情况，1～4分为造模成功，因为4分小鼠损伤过于严重，故取1～3分小鼠入组[12]，最终入组27只小鼠，每组9只小鼠。I/R+CMS121组在构建模型前后给予CMS121的体内治疗，即CMS121按照每次25 mg/kg的剂量，分别在I/R模型构建前12 h和再灌注后0、3、6 h经腹腔注射至模型小鼠体内。Sham组进行假手术，小鼠同样进行大脑中动脉的切口及缝合，但不插入线栓。

1.3.2 小鼠神经严重度评分（NSS） 在经上述处理24 h后对3组小鼠进行NSS[11]，以NSS表示小鼠神经功能受损情况。

1.3.3 TTC染色和小鼠脑梗死体积测量 完成NSS后，将小鼠麻醉处死，各组随机选择3只小鼠分离脑组织。将脑组织短暂冰冻后，制备冠状切片。将切片浸泡于质量浓度为20 g/L的TTC溶液中，37 ℃下避光孵育30 min。之后即使用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛组织细胞固定液在4 ℃下固定过夜。由于TTC是一种脂溶性光敏感复合物，可进入细胞，被活细胞内的脱氢酶还原为红色甲臢化合物。梗死区域组织坏死，脱氢酶活力丧失而呈现灰白色，非梗死区域则呈现红色。收集图像后，使用Image J软件分析小鼠脑梗死体积。

1.4 统计分析

使用 GraphPad Prism 软件进行统计学分析。计量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，Western Blot实验结果采用析因设计的方差分析进行比较，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有显著性。

2 结  果

2.1 3组神经元的细胞活力和LDH释放量比较

细胞活力检测结果显示，对照组、OGD/R组以及OGD/R+CMS121组神经元的细胞活力分别为（100.00±4.98）%、（58.79±3.11）%、（72.62±4.59）%，各组神经元细胞活力比较差异具有显著性（F=71.21，P＜0.01）；与对照组相比，OGD/R组神经元的细胞活力显著降低，差异具有显著意义（t=16.58，P＜0.01）；与OGD/R组相比较，OGD/R+CMS121组神经元的细胞活力得到显著改善，差异有显著性（t=5.56，P＜0.05）。

细胞LDH释放检测结果显示，对照组、OGD/R组和OGD/R+CMS121组神经元LDH释放量分别为（16.64±0.84）%、（79.09±2.63）%、（40.19±9.64）%，各组神经元LDH释放量比较差异有显著性（F=88.93，P＜0.01）；与对照组相比，OGD/R组神经元LDH释放量增加，差异具有统计意义（t=18.67，P＜0.01）；与OGD/R组相比较，OGD/R+CMS121组LDH释放量下降，差异有统计意义（t=11.63，P＜0.01）。

2.2 3组神经元OGD/R不同时间点Akt、p-Akt相对表达量和p-Akt/Akt比较

析因设计的方差分析结果显示，时间对神经元p-Akt/Akt、p-Akt相对表达量有明显影响（F时间=21.98、27.55，P＜0.01）；分组对神经元p-Akt/Akt和p-Akt相对表达量具有明显影响（F组间=53.71、32.67，P＜0.01）；时间和分组的交互作用对神经元p-Akt/Akt、p-Akt相对表达量有明显影响（F交互=13.46、13.48，P＜0.01）。时间、分组、时间和分组交互作用对神经元Akt的相对表达量均无明显影响（P＞0.05）。再灌注6 h，3组神经元p-Akt/Akt和p-Akt相对表达量比较差异有显著性（F=53.52、18.78，P＜0.01）；与对照组相比较，OGD/R组和OGD/R+CMS121组神经元p-Akt/Akt和p-Akt相对表达量均升高（P＜0.01）；OGD/R组和OGD/R+CMS121组神经元p-Akt/Akt和p-Akt相对表达量比较差异无显著性（P＞0.05）。再灌注24 h，3组神经元p-Akt/Akt和p-Akt相对表达量比较差异有显著性（F=36.19、38.50，P＜0.01）；OGD/R+CMS121组p-Akt/Akt和p-Akt相对表达量较对照组和OGD/R组相比均升高（P＜0.01），OGD/R組和对照组相比，p-Akt/Akt和p-Akt相对表达量比较差异无显著性（P＞0.05）。见表1，图1。

2.3 3组小鼠NSS比较

再灌注24 h以后，Sham组、I/R组以及I/R+CMS121组小鼠的NSS分别为0.01±0.01、3.89±1.76、2.33±1.41，各组NSS比较差异均具有显著意义（F=20.24，P＜0.001）；与I/R组相比，I/R+CMS121组小鼠NSS明显降低（P＜0.05）。

2.4 3组小鼠脑梗死体积占全脑体积的比例比较

TTC染色结果显示，Sham组、I/R组、I/R+CMS121组小鼠的脑梗死体积占全脑体积的比例分别为（1.65±0.54）%、（36.71±2.40）%、（20.05±1.38）%，各组比较差异有显著性（F=118.60，P＜0.01）；I/R组小鼠脑小鼠脑梗死体积占全脑体积的比例明显高于Sham组（P＜0.01）；与I/R组相比，I/R+CMS121组小鼠脑梗死体积占全脑体积的比例明显降低（P＜0.01）。见图2。

3 讨  论

I/R脑损伤的机制复杂，目前国内外学者普遍认为I/R损伤主要与细胞内线粒体和NADPH氧化酶中的自由基过度形成、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎性反应等机制有关[13-14]。近年来能量代谢与神经系统疾病的关系被广泛关注[15-17]。尽管葡萄糖是脑组织能量来源的主要底物，但利用其他循环底物如酮体脂肪酸等，能够使脑组织适应能量缺乏的状态。其中ACC1是脂肪酸代谢的关键酶[18-19]。

目前研究表明，通过影响ACC1的表达或活性来调节脂肪酸代谢，能对肥胖、糖尿病、肿瘤等多种疾病起到治疗作用[20-22]。近几年来研究结果显示，ACC1能够通过参与免疫炎症反应加重I/R脑损伤[5，23]。CMS121是ACC1的抑制剂，近期研究显示CMS121在神经退行性病变如AD中，显示出强大的神经保护作用[6-9]。然而，对于CMS121在I/R脑损伤中的作用，目前未见报道。本研究通过体内实验证明，CMS121能够改善OGD/R处理的神经元的细胞活力，并且能够抑制神经元的LDH释放，这意味着CMS121能够减弱OGD/R诱导的神经元损伤，减少神经元凋亡。体外实验研究结果显示，CMS121治疗能够明显降低I/R脑损伤模型小鼠的NSS，减少I/R脑损伤模型小鼠的脑梗死体积，进一步证实了CMS121对于I/R脑损伤具有神经保护作用。

Akt的激活對于I/R脑损伤的神经元存活具有重要的影响[24]。Akt通路能够调控Bcl-2、Bax以及caspase-3等线粒体相关凋亡蛋白的表达，参与Nrf2激活，促进神经元的存活，减轻I/R损伤[25-31]。根据以前的报道，在I/R的早期（3～6 h），缺血区域脑组织Akt会被激活，p-Akt水平升高；而在I/R的晚期（12～24 h），该区域脑组织p-Akt水平降低[32]。本研究结果显示，再灌注6 h时，OGD/R处理使神经元的p-Akt水平升高，CMS121对该阶段的p-Akt水平影响不大。再灌注24 h时，OGD/R处理的神经元p-Akt水平已经降低，而经过CMS121的治疗，24 h时神经元p-Akt的水平仍旧升高。这可能表明，CMS121可能是通过持续升高p-Akt的水平，发挥神经保护作用的。

综上所述，本研究结果显示，CMS121对于I/R脑损伤具有神经保护作用。CMS121能够持续升高大脑皮质神经元中的p-Akt水平，可能是通过激活Akt通路，发挥神经保护作用的。但CMS121如何通过Akt通路发挥神经保护作用还需要进一步研究确定。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学科学伦理委员会的审核批准（文件号20211210C57332-0220-59220018）。所有实验过程均遵照《实验动物管理条例》的规定进行。

作者声明：徐锐、孙成建、赵志远参与了研究设计；赵志远、赵睿、刘文豪参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。

［参考文献］

[1] BOEHME A K， ESENWA C， ELKIND M S V. Stroke risk factors， genetics， and prevention[J]. Circ Res， 2017，120（3）：472-495.

[2] YANG J L， MUKDA S， CHEN S D. Diverse roles of mitochondria in ischemic stroke[J]. Redox Biol， 2018，16：263-275.

[3] THIANKHAW K， CHATTIPAKORN N， CHATTIPAKORN S C. The effects of hyperbaric oxygen therapy on the brain with middle cerebral artery occlusion[J]. J Cell Physiol， 2021， 236（3）：1677-1694.

[4] JIN W N， GONZALES R， FENG Y， et al. Brain ischemia induces diversified neuroantigen-specific T-cell responses that exacerbate brain injury[J]. Stroke， 2018，49（6）：1471-1478.

[5] WANG X， ZHOU Y X， TANG D， et al. ACC1 （acetyl coenzyme A carboxylase 1） is a potential immune modulatory target of cerebral ischemic stroke[J]. Stroke， 2019，50（7）：1869-1878.

[6] PRIOR M， CHIRUTA C， CURRAIS A， et al. Back to the future with phenotypic screening[J]. ACS Chem Neurosci， 2014，5（7）：503-513.

[7] CURRAIS A， HUANG L， GOLDBERG J， et al. Elevating acetyl-CoA levels reduces aspects of brain aging[J]. Elife， 2019，8：e47866.

[8] ATES G， GOLDBERG J， CURRAIS A， et al. CMS121， a fatty acid synthase inhibitor， protects against excess lipid pe-roxidation and inflammation and alleviates cognitive loss in a transgenic mouse model of Alzheimers disease[J]. Redox Biol， 2020，36：101648.

[9] KEPCHIA D， CURRAIS A， DARGUSCH R， et al. Geroprotective effects of Alzheimers disease drug candidates[J]. Aging （Albany NY）， 2021，13（3）：3269-3289.

[10] ZHANG Z L， WANG Q H， ZHAO X L， et al. YTHDC1 mi-tigates ischemic stroke by promoting Akt phosphorylation through destabilizing PTEN mRNA[J]. Cell Death Dis， 2020，11（11）：977.

[11] CUI Y， ZHANG Y， ZHAO X L， et al. ACSL4 exacerbates ischemic stroke by promoting ferroptosis-induced brain injury and neuroinflammation[J]. Brain Behav Immun， 2021，93：312-321.

[12] 盧小叶，吕倩忆，李棋龙，等. Zea-longa评分与改良Garcia评分应用于针刺治疗CIRI大鼠神经功能缺损评估的研究[J]. 湖南中医药大学学报， 2021，41（9）：1356-1360.

[13] LIN L， WANG X， YU Z. Ischemia-reperfusion injury in the brain： Mechanisms and potential therapeutic strategies[J]. Biochem Pharmacol （Los Angel）， 2016，5（4）：213.

[14] DIRNAGL U， IADECOLA C， MOSKOWITZ M A. Patho-biology of ischaemic stroke： An integrated view[J]. Trends Neurosci， 1999，22（9）：391-397.

[15] SILVA-ADAYA D， GARZA-LOMB C， GONSEBATT M E. Xenobiotic transport and metabolism in the human brain[J]. Neurotoxicology， 2021，86：125-138.

[16] ZHANG S， LACHANCE B B， MATTSON M P， et al. Glucose metabolic crosstalk and regulation in brain function and diseases[J]. Prog Neurobiol， 2021，204：102089.

[17] SERTBAS M， ULGEN K O. Unlocking human brain metabolism by genome-scale and multiomics metabolic models： Relevance for neurology research， health， and disease[J]. OMICS A J Integr Biol， 2018，22（7）：455-467.

[18] RAICHLE M E， GUSNARD D A. Appraising the brains energy budget[J]. PNAS， 2002，99（16）：10237-10239.

[19] CAHILL G F Jr. Fuel metabolism in starvation[J]. Annu Rev Nutr， 2006，26：1-22.

[20] FULLERTON M D， GALIC S， MARCINKO K， et al. Single phosphorylation sites in Acc1 and Acc2 regulate lipid homeostasis and the insulin-sensitizing effects of metformin[J]. Nat Med， 2013，19（12）：1649-1654.

[21] YE B Y， YIN L， WANG Q W， et al. ACC1 is overexpressed in liver cancers and contributes to the proliferation of human hepatoma Hep G2 cells and the rat liver cell line BRL 3A[J]. Mol Med Rep， 2019，19（5）：3431-3440.

[22] LALLY J S V， GHOSHAL S， DEPERALTA D K， et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase by phosphorylation or the inhibitor ND-654 suppresses lipogenesis and hepatocellular carcinoma[J]. Cell Metab， 2019，29（1）：174-182.e5.

[23] ENDO Y， ONODERA A， OBATA-NINOMIYA K， et al. ACC1 determines memory potential of individual CD4+ T cells by regulating de novo fatty acid biosynthesis[J]. Nat Metab， 2019，1（2）：261-275.

[24] XU X S， CHUA C C， GAO J P， et al. Neuroprotective effect of humanin on cerebral ischemia/reperfusion injury is mediated by a PI3K/Akt pathway[J]. Brain Res， 2008，1227：12-18.

[25] LIN K H， KUO W W， JIANG A Z， et al. Tetrame-thylpyrazine ameliorated hypoxia-induced myocardial cell apoptosis via HIF-1α/JNK/p38 and IGFBP3/BNIP3 inhibition to upregulate PI3K/Akt survival signaling[J]. Cell Physiol Biochem， 2015，36（1）：334-344.

[26] YU Z H， CAI M， XIANG J， et al. PI3K/Akt pathway contributes to neuroprotective effect of Tongxinluo against focal cerebral ischemia and reperfusion injury in rats[J]. J Ethnopharmacol， 2016，181：8-19.

[27] HOU Y Y， WANG K， WAN W J， et al. Resveratrol provides neuroprotection by regulating the JAK2/STAT3/PI3K/AKT/mTOR pathway after stroke in rats[J]. Genes Dis， 2018，5（3）：245-255.

[28] LI L T， ZHANG X J， CUI L L， et al. Ursolic acid promotes the neuroprotection by activating Nrf2 pathway after cerebral ischemia in mice[J]. Brain Res， 2013，1497：32-39.

[29] SHAH Z A， LI R C， THIMMULAPPA R K， et al. Role of reactive oxygen species in modulation of Nrf2 following ischemic reperfusion injury[J]. Neuroscience， 2007，147（1）：53-59.

[30] LI M H， CHA Y N， SURH Y J. Peroxynitrite induces HO-1 expression via PI3K/Akt-dependent activation of NF-E2-rela-ted factor 2 in PC12 cells[J]. Free Radic Biol Med， 2006，41（7）：1079-1091.

[31] LIU Q， JIN Z Q， XU Z L， et al. Antioxidant effects of ginkgolides and bilobalide against cerebral ischemia injury by activating the Akt/Nrf2 pathway in vitro and in vivo[J]. Cell Stress Chaperones， 2019，24（2）：441-452.

[32] WANG X T， PEI D S， XU J， et al. Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by Akt1 and JNK1/2 on ischemic brain injury[J]. Cell Signal， 2007，19（9）：1844-1856.

（本文編辑 耿波 厉建强）