TGF-β1干预构建的人支气管上皮细胞上皮-间质转化模型中lncRNA和miRNA表达及其意义
2023-04-29陈华培杨召川李蕾曲政海
陈华培 杨召川 李蕾 曲政海
[摘要] 目的 探討人转化生长因子β1(TGF-β1)干预构建的人支气管上皮细胞16HBE上皮-间质转化(EMT)模型中lncRNA和miRNA的表达情况。方法 体外培养16HBE细胞,设立对照组和处理组。处理组以TGF-β1诱导细胞构建EMT细胞模型,对照组加入等量RPMI基础培养液。分别于TGF-β1处理细胞后24、48、72 h使用倒置显微镜观察两组细胞形态及分布。当处理组细胞开始出现明显梭形改变时,采用RNA分离、逆转录以及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测两组细胞中lncRNA和miRNA相对表达量。结果经TGF-β1处理细胞48 h后,处理组细胞梭形改变明显,细胞间隙增大,显示EMT模型构建成功。同时在该时间点,两组细胞中TBILA、NKILA、LNCRNA-ATB、HOTAIR、NEAT1、miR-125b-5p、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-141-3p、miR-200c-3p、miR-17-5p、miR-34a-5p的相对表达量比较差异均具有显著意义(t=-16.353~6.460,P<0.05)。结论 TGF-β1干预能够成功构建EMT细胞模型,该细胞模型中的细胞与正常细胞相比,多个lncRNA和miRNA表达具有显著差异。上述基因可能参与了EMT或气道重塑的形成和发展,或许为这些疾病的防治提供分子理论支持。
[关键词] RNA,长链非编码;微RNAs;转化生长因子β1;上皮-间质转化;上皮细胞;气道重塑;纤维化
[中图分类号] R329.25;R394 [文献标志码] A
[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of long non-coding RNAs (lncRNAs) and microRNAs (miRNAs) in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) model of human bronchial epithelial cell line 16HBE induced by human transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Methods 16HBE cells were cultured in vitro, and the experiment established control group and treatment group. The cells in the treatment group were induced by TGF-β1 to establish an EMT cell model, and those in the control group were added with an equal volume of RPMI basic culture medium. At 24, 48, and 72 h after TGF-β1 treatment, an inverted microscope was used to observe cell morphology and distribution. At the time point when the cells in the treatment group began to show obvious spindle-shaped changes, the methods of RNA separation, reverse transcription, and quantitative real-time PCR were used to measure the relative expression levels of lncRNAs and miRNAs in the two groups. Results After 48 h of TGF-β1 treatment, the cells in the treatment group showed obvious spindle-shaped changes and an increase in intercellular space, suggesting that the EMT model was successfully established. At this time point, there were significant differences between the two groups in the relative expression levels of TBILA, NKILA, LNCRNA-ATB, HOTAIR, NEAT1, miR-125b-5p, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-141-3p, miR-200c-3p, miR-17-5p, miR-34a-5p(t=-16.353-6.460,P<0.05). Conclusion TGF-β1 intervention can successfully establish the EMT cell model, and the differentially expressed lncRNAs and miRNAs between this cell model and normal cells may be involved in the formation and development of EMT or airway remodeling, which might provide a theoretical basis for the prevention and treatment of such diseases.
[KEY WORDS] RNA, long noncoding; MicroRNAs; Transforming growth factor beta1; Epithelial-mesenchymal transition; Epithelial cells; Airway remodeling; Fibrosis
上皮-间质转化(EMT)是一种不具有迁移能力的上皮细胞在各种原因诱发下,失去上皮标志物、获得间质表型并转化为间质细胞,致细胞形态呈长梭形改变,并获得迁移能力的过程。其在组织发育、疾病发生发展中发挥着重要作用[1]。转化生长因子β(TGF-β)属于相关生长因子超家族一员,相关信号通路在控制组织发育、增殖、分化、凋亡和稳态中发挥着关键性作用[2]。本课题组前期研究发现,经过TGF-β1处理后,人支气管上皮细胞(16HBE)发生EMT,并参与哮喘气道重塑和纤维化的过程[3-5]。
基因转录本不翻译成蛋白质,但是可以直接作为结构分子、调节分子或者催化分子发挥作用,此类RNA称为非编码RNA(ncRNA)[6]。ncRNA(例如lncRNA和miRNA)在气道重塑和气道纤维化相关的EMT形成过程中作用的研究报道较少。本研究拟通过TGF-β1干预构建人16HBE EMT细胞模型,探讨EMT细胞模型中lncRNA和miRNA相对表达量的变化,为气道纤维化或气道重塑防治方面的研究提供分子理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
人16HBE细胞(源自中国医学科学院肿瘤细胞库),特级胎牛血清、RPMI1640基础培养基、青霉素-链霉素溶液(双抗)(武汉普诺赛生命科技有限公司),TGF-β1蛋白(MedChemexpress生物科技公司,美国),RNA-easy Isolation Reagent(南京诺唯赞生物科技股份有限公司),Evo M-MLV反转录预混型试剂盒以及miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司),2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix(武汉赛维尔生物科技有限公司)。
1.2 研究方法
1.2.1 細胞培养和处理 16HBE细胞复苏后,置于含体积分数0.10胎牛血清以及10 g/L青霉素-链霉素的RPMI1640生长培养基中,每2~3 d换液1次,待融合度达80%~90%时进行传代。将细胞接种于6孔板中,每孔约30~50万个细胞,每孔加入生长培养基2 mL,分为对照组和处理组,每组设3个复孔。接种当天,处理组每孔中加入TGF-β1,使其在培养基中浓度约为10 μg/L,而对照组中加入与处理组TGF-β1等体积的RPMI基础培养基;分别于细胞处理24、48、72 h后使用倒置显微镜观察两组细胞形态及分布,当处理组细胞形态明显梭形改变、细胞间隙增大时,表明EMT细胞模型已构建成功,记录该时间点,以此作为后续实验处理时间。
1.2.2 RNA分离、逆转录及RT-qPCR检测 根据RNA-easy Isolation Reagent说明书,当EMT细胞模型构建成功时,分别分离并提取上述两组细胞中总RNA,紫外可见分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。根据说明书,采用Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒和miRNA cDNA 第一链合成试剂盒对分离RNA行反转录,两种试剂反转录的cDNA分别进行下一步lncRNA或miRNA的RT-qPCR检测。除了miRNA的下游引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司提供以外,lncRNA和miRNA的其他引物均由深圳华大基因股份有限公司进行合成(表1)。其中GAPDH作为lncRNA的内参基因,U6(湖南艾科瑞生物工程有限公司)作为miRNA的内参基因。再使用2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix对经反转录生成的cDNA进行RT-qPCR,获得各组样本扩增CT值,采用2-△△CT方法计算各基因的相对表达量。
2 结 果
2.1 经过TGF-β1处理后两组细胞不同时间点形态比较
倒置显微镜观察结果显示,对照组16HBE细胞第24、48、72小时时均为鹅卵石样或铺路石样的单层细胞,细胞间连接紧密,聚集成团状或岛状。处理组细胞在第24小时时形态和分布变化不明显;而第48和72小时时呈长梭形,细胞与细胞间连接不紧密,间隙增大,细胞发生了EMT(图1)。第48小时时EMT细胞模型已经构建成功。
2.2 两组细胞中各lncRNA和miRNA相对表达量比较
两组细胞处理48 h后进行RT-qPCR检测,处理组中各lncRNA和miRNA的相对表达量与对照组比较,差异均具有显著性(t=-16.353~6.460,P<0.05)。见表2。
3 讨 论
气道纤维化和气道重塑是不可逆的呼吸系统疾病,严重影响患者的生活质量,其预防和治疗仍然是目前世界范围内亟待解决的难题。ncRNA在气道纤维化和气道重塑中发挥着重要作用,参与疾病的发生和发展,但相关研究报道较少。本研究通过构建EMT细胞模型,模拟气道纤维化,探讨细胞中lncRNA和miRNA的表达情况,为气道纤维化以及气道重塑的预防或治疗提供数据参考。
本研究中,TGF-β1处理16HBE 细胞48 h后,细胞形态呈长梭形,细胞与细胞间连接不再紧密,间隙增大,提示细胞已经发生了EMT,细胞模型构建成功。研究发现TGF-β对EMT有诱导或者促进作用,但相关机制研究较少。WANG等[7] 体外研究发现,TGF-β1可通过刺激人肺癌细胞抑制Src同源物2-b3 (SH2B3,又称淋巴细胞接头蛋白)的表达,激活JAK2/STAT3和SHP2/Grb2/PI3K/AKT信号通路级联反应,促进人肺癌细胞EMT以及肺癌细胞扩散、转移。PEZONE等[8]体外培养人正常乳腺上皮细胞(MCF10A)并通过共聚焦显微镜和质谱记录分析发现,组蛋白溶酶特异性去甲基化酶1 (LSD1) 与TGF-β1诱导或抑制基因的启动子结合后,可引发一系列DNA氧化反应,调控EMT基因的转录或抑制。DAVID等[9]发现调控因子Sox4可以使TGF-β诱导的EMT的胰腺导管腺癌细胞发生凋亡,而胃肠谱系主调控因子Klf5则具有拮抗Sox4凋亡作用,提示在胰腺导管腺癌细胞中EMT进程可能是受Sox4和Klf5同时调控。
本课题组前期实验发现miR-448-5p在哮喘小鼠肺组织和TGF-β1干预后16HBE中的相对表达量均下调,同时在TGF-β1干预后的16HBE中过表达miR-448-5p可以抑制TGF-β1介导的EMT以及气道纤维化[4],提示ncRNA在气道纤维化或气道重塑中发挥作用。
本研究结果显示,与对照组相比,处理组细胞中TBILA等lncRNA和miR-125b-5p等miRNA基因的相对表达量存在显著差异,这些差异均发现与EMT进程的调控或组织纤维化的形成发展密切相关。如TBILA在非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织中以及TGF-β1处理的A549和H226细胞中表达上调,沉默或者过表达TBILA可以分别产生抑制或促进A549和H226细胞EMT作用[10]。NKILA在人肝癌组织和人肝癌细胞系中表达下调,在体外NKILA过表达则能够显著抑制肝癌细胞系细胞EMT[11]。体外研究结果显示,HOTAIR在经过TGF-β1处理后的结肠癌细胞株HT-29及DLD1、乳腺上皮细胞MCF10a以及乳腺癌細胞株HCC1954中均表达上调,经siRNA干扰HOTAIR表达后,可改变TGF-β诱导的EMT进展过程[12]。LNCRNA-ATB在草酸钙刺激人近端肾小管上皮(HK-2)细胞的EMT模型中表达上调,miR-200家族基因表达下调,干扰lncRNA-ATB表达或者转染miR-200a模拟物均可缓解EMT进程和肾损伤程度[13]。在牛血清白蛋白(BSA)刺激的HK-2细胞和高脂饲料和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中NEAT1的表达均显著上调,通过干扰或者过表达NEAT1可分别抑制或者促进BSA诱导HK-2细胞的纤维化和EMT[14]。另外,miR-125b在结直肠癌(CRC)原发灶和转移灶中表达上调,而体外培养的CRC细胞过表达miR-125b可增强EMT的迁移能力,敲低miR-125b表达后,可以降低CRC细胞EMT的迁移和侵袭能力[15]。miR-21-5p、miR-34a-5p的表达水平在人CRC组织中较正常组织高,而miR-200c-3p的表达水平则较低,这些miRNA均与肿瘤组织的EMT相关[16]。miR-17-5p在有转移的原发性人CRC组织中的表达量低于无转移的原发性人CRC组织,过表达miR-17-5p后体外培养的CRC细胞EMT能力受到抑制,而抑制miR-17-5p的表达则增强了CRC细胞的EMT能力[17]。
LncRNA、miRNA及其下游基因之间还可互相调控,并形成复杂的调控网络,参与蛋白质翻译、合成的一系列过程,进而抑制或者促进细胞EMT以及组织纤维化。例如,lncRNA BBOX1-AS1在人NSCLC组织中,以及体外培养并经转录因子KLF5诱导的NSCLC细胞中均为高表达,BBOX1-AS1与miR-27a-5p竞争性结合,促进母体胚胎亮氨酸拉链激酶表达,激活黏着斑激酶磷酸化,促进NSCLC细胞的EMT[18]。
综上所述,本研究成功构建了EMT细胞模型,与正常细胞相比,该模型中多个lncRNA和miRNA表达具有显著差异。这些基因间可能存在复杂的调控网络,促进或抑制16HBE细胞EMT及其进程。后续应进行更深入的实验研究,进一步明确各基因调控机制以及他们之间的调控关系,为气道纤维化或气道重塑防治方面的研究提供分子理论支持。
作者声明:曲政海、杨召川、陈华培参与了研究设计;所有作者参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。
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(本文編辑 耿波 厉建强)