黄连解毒颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷含量测定

李军鸽，邱智东，赵 莹，王永春，孟珈同，唐秋竹

（长春中医药大学·吉林 长春·130117）

黄连解毒颗粒来自于经典名方《外台秘要》黄连解毒汤原方，主治清热泻火[1-3]。黄连解毒颗粒是由传统黄连解毒汤处方比例按现代提取工艺配制而成的颗粒剂。黄连解毒汤为清热解毒的经典方剂，由黄连、黄柏、黄芩、栀子四味药组成，其临床疗效显著[4-5]，被广大医者应用至今。为解决汤剂存储、服用和携带不便的特点，从遵古和传承角度出发，课题组前期已对黄连解毒汤的物质基准和黄连解毒颗粒制备工艺进行研究，由于方中黄连为君药，黄芩为臣药，盐酸小檗碱为黄连的主要生物碱成分，黄芩苷为黄芩的主要代表成分，故本研究通过测定黄连解毒颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷化学成分含量研究，以期为黄连解毒颗粒的质量标准制定提供参考。

1 材料与仪器

高效液相色谱仪（紫外检测器，岛津LC2030）；电子天平（万分之一，梅特勒ME204E）；超声波清洗机（昆山KQ-600B）；盐酸小檗碱对照品 （纯度85.9%，111638-201907），黄 芩 苷 对 照 品（纯 度93.3%，110715-201318）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（Fisher，色谱纯）；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。黄连、黄芩、黄柏和栀子饮片各3批，均购于吉林省北药药材加工有限公司，由长春中医药大学翁丽丽教授鉴定。药材饮片和黄连解毒颗粒信息表见表1。

表1 药材饮片和黄连解毒颗粒信息表

2 方法

2.1 黄连解毒颗粒制备

按处方比例取黄连、黄芩、黄柏、栀子四味药材，第一次加12倍量水，浸泡1小时，第二次加10倍量水，煎煮两次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩 至 相 对 密 度1.03～1.10（75℃）稠 膏，干 燥，粉 碎 成 细粉，加糊精和75%乙醇适量，制成颗粒，60℃干燥，整粒，即 得[6-7]。共 制 备 三 批 样 品20220101、20220102、20220103。

2.2 含量测定

2.2.1色谱条件

Pepax C18（250mm×4.6mm，5μm）色 谱 柱，流 动 相乙 腈-0.1%磷 酸（27∶73），检 测 波 长354nm，柱 温30℃，流速1.0mL/min，对照品和供试品进样量均为5μL。

2.2.2对照品溶液制备

分别取盐酸小檗碱和黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含0.1mg的混合对照品溶液，备用。

2.2.3供试品溶液制备

取黄连解毒颗粒，研细，精密称定1.0g，精密加1%盐酸甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟（250W，50HZ），放冷，甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，备用。

3 结果

3.1 系统适应性试验

取对照品溶液、供试品溶液和糊精阴性样品溶液，按“2.2.1”色谱条件进行测定，记录色谱图，如图1、图2、图3，对照品色谱图与供试品色谱图相同保留时间处都有相应色谱峰，分离度符合要求，峰型较好，阴性样品溶液无干扰，该方法专属性好。

图1 对照品色谱（1盐酸小檗碱，2黄芩苷）

图2 供试品品色谱（1盐酸小檗碱，2黄芩苷）

图3 阴性色谱图

3.2 线性

取12.29 mg盐酸小檗碱对照品加甲醇定容于50mL量瓶中，分别再加甲醇稀释成0.0132、0.0264、0.0352、0.0528、0.1056、0.2112mg/mL浓 度 的 对 照 品 溶液，取10.56mg黄芩苷对照品加甲醇定容于50mL量瓶中，分别再加甲醇稀释成0.0164、0.0328、0.065、0.0985、0.1313mg/mL浓度对照品溶液，精密吸取不同浓度盐酸小檗碱和黄芩苷对照品溶液各5μL，按“2.2.1”依 法 测 定，以 进 样 量（μg）为 横 坐 标，峰 面 积 值为纵坐标，进行线性关系考察，结果见表2。

表2 线性结果

3.3 精密度

取 黄 连 解 毒 颗 粒 样 品（20220101）按“2.2.3”方 法制备供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件依法测定，连续测定6次，进样量5μL，记录色谱峰面积值，计算RSD%，结果盐酸小檗碱RSD为1.21%，黄芩苷RSD为0.98%，表明仪器精密度良好。

3.4 稳定性

取黄连解毒颗粒样品 （20220101），精密称定1.0g，按“2.2.3”方 法 制 备 供 试 品 溶 液，按“2.2.1”色 谱条 件 依 法 测 定，进 样 量 为5μL，分 别 于0、2、4、8、12、24 h进行测定，纪录峰面积，结果盐酸小檗碱和黄芩苷的RSD分别为1.05 %、1.01%，表明供试品溶液在24 h内 稳 定[8-10]。

3.5 重复性

取 黄 连 解 毒 颗 粒 样 品（20220101）6份，按“2.2.3”方法，平行制备供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件依法测定，经计算，盐酸小檗碱含量34.88 mg/g，RSD为1.23 %；黄芩苷含量6.72 mg/g，RSD为1.17 %，表明该 方 法 重现 性 良好[11-13]。

3.6 加样回收率

为考察拟定方法测定结果与真实值接近的程度，对拟定方法进行准确度试验。取黄连解毒颗粒样品（20220101，盐酸小檗碱34.88mg/g，黄芩苷含量6.72 mg/g）6份，每份约0.5g，精密称定，分别精密加入盐酸小檗碱对照品约23mg（纯度85.9%），黄芩苷对照品3mg（纯度93.3%），按拟定方法测定，结果盐酸小檗碱回收率平均值为98.53%，RSD为1.48 %，黄芩苷回收率平均值为99.24%，RSD为1.65%，结果见表3，表明该方法准确度良好。

表3 盐酸小檗碱和黄芩苷加样回收率结果

3.7 三批样品含量测定

取黄连解毒颗粒三批样品（20220101、20220102、20220103），分 别 按“2.2.3”方 法 制 备 供 试 品 溶 液，按“2.2.1”色谱条件依法测定，计算各批盐酸小檗碱和黄芩苷含量，结果见表4。

表4 黄连解毒颗粒三批样品含量测定结果

4 讨论

黄连解毒颗粒是从遵古与传承思想角度开发的经典名方制剂，为了后期的质量控制，筛选一种或几种含量指标进行监测制剂质量有利于新药开发的整体性研究。黄连解毒颗粒由黄连、黄芩、黄柏和栀子四味药组成，指标成分应首选君药黄连和臣药黄芩中的成分，参考2020版《中国药典》一部黄连和黄芩项下的含量测定项，选择盐酸小檗碱和黄芩苷为黄连解毒颗粒主要指标成分。

黄连解毒颗粒为水煎提取得到的干膏加辅料制成的颗粒剂，含量测定在成分提取方法中对比了加热回流和超声的方法，对于盐酸小檗碱超声和回流提取方法含量相差不多，为了实验操作简便可选超声提取，对于黄芩苷超声提取比回流提取含量低约10%，由于黄连解毒颗粒中黄芩苷含量较盐酸小檗碱含量低，且黄芩苷为臣药有效代表成分，是次要有效成分，综合考虑，提取方法选择超声法。且通过单因素试验对提取时间和提取溶剂量进行筛选，最终确定超声提取时间为30分钟，提取溶剂量为50mL。

对于制剂多种成分含量测定，流动相的选择尤为重要，本研究参考《中国药典》2020版和相关文献[14-16]对流动相组成和比例进行考察筛选，黄芩苷流动相选择较宽泛，容易得到较好的峰型，盐酸小檗碱峰型较差易拖尾，且分离度不易达到要求，故考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾，乙腈-磷酸水及不同比例的流动相，最终以乙腈-0.1%磷酸水（27∶73）为 流 动 相，得 到 的 峰 型 较 好，分 离 度＞1.5，同 时对柱温与流速等色谱条件进行了考察。本研究所建方法方便快速、准确、专属性强[17-20]，适合用于黄连解毒颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷含量测定，为黄连解毒颗粒质量控制研究提供参考。