液相色谱法检测鸡肉中芬苯达唑及其代谢物残留

赵欣然 ，齐文婷 ，张伟 ，通信作者

（1.天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；2.天津药物研究院，天津 300450）

芬苯达唑（Fenbendazole）属于苯并咪唑类（Ben zimidazoles）药物，对胃肠道线虫、网尾线虫、片形吸虫和绦虫均有良好的驱虫效果[1]。与苯并咪唑类其他药物相同，芬苯达唑通过破坏微管蛋白组装聚合，引起虫体代谢障碍，导致生长发育受阻，甚至引起寄生虫死亡[2]。作为抗寄生虫药，芬苯达唑具有驱虫谱广、效果好、毒性低等特点，广泛应用于兽医和人医临床。另外，芬苯达唑还是一种潜在的抗癌药[3-4]。芬苯达唑的代谢产物为芬苯达唑砜（Fenbendazole Sulphone）和芬苯达唑亚砜（Fenbendazole Sulphoxide）。芬苯达唑亚砜又被称为奥芬达唑（Oxfendazole），也具有驱蠕虫作用，活性比芬苯达唑强，驱虫谱与芬苯达唑相同[1]。奥芬达唑和芬苯达唑可以相互转化，但是芬苯达唑砜不能进行再代谢[5]。其分子式如图1所示。

图1 芬苯达唑及其代谢物的化学式图

芬苯达唑和奥芬达唑具有致畸作用，且残留于动物机体的药物可以随食物链对人体造成伤害。各国均设定了动物性食品中该类物质的残留限量[6-7]。

目前，检测芬苯达唑及其代谢物残留的方法有气相色谱[8-9]、液相色谱[10-11]、液质联用[12-14]，ELISA[15]等方法。液质联用具有检测限低、同时可检测多种药物残留的特点[12-14]，但是液质联用的价钱非常高，不适合基层使用。气相色谱的灵敏度不高，且芬苯达唑及其衍生物的检测需要进行衍生化，因此逐渐被高灵敏度、高特异性的检测器所代替。ELISA的假阳性较多，且检测限偏高。

本文采用 SPE-HPLC（紫外检测器）检测鸡肉中芬苯达唑及其代谢物残留。方法简单可行，可满足残留检测，适用于基层动物组织中芬苯达唑及其代谢物残留检测。

1 材料

1.1 试验材料

取鸡肉，绞碎，匀浆，-20 ℃冷冻保存。

1.2 药品和试剂

乙腈和甲醇，色谱纯，均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；芬苯达唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑，色谱纯，均购自SIGMA公司；乙酸铵和无水硫酸钠，色谱纯，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯和正己烷，分析纯，均购自天津市光复科技发展公司；磷酸，分析纯，购自天津市富宇精细化工有限公司；二甲基亚砜，分析纯，购自天津博迪化工股份有限公司；纯净水，购自娃哈哈公司； C18固相萃取柱，购自大连中谱科技有限公司。

1.3 仪器设备

高效液相色谱仪配紫外检测器（Agilent-1260）购自安捷伦科技有限公司；ODS-3色谱柱（5 μm，4.6 mm×250.0 mm）购自岛津企业管理（中国）有限公司；氮吹仪（DC-12）购自上海安谱实验科技股份有限公司；微型漩涡混合仪（WH-2）购自上海沪西分析仪器厂；恒温水浴锅（DC-12H）购自上海安谱实验科技股份有限公司。

1.4 标准溶液配置

标准储备液: 取芬苯达唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑10 mg，置于10 mL容量瓶，加入0.5 mL二甲基亚砜，然后加入甲醇定容，配制成浓度为1 mg/mL的混合溶液。

标准工作液：用流动相（乙腈∶5 mol/L乙酸铵水溶液＝1∶1）将芬苯达唑、芬苯达唑砜和奥芬达唑的储备液稀释，配制成浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL 的标准溶液。

2 试验方法

2.1 色谱条件

ODS-3色谱柱（5 μm，4.6 mm×250.0 mm），流动相A相为5 mol/L乙酸铵水溶液，B相为乙腈。流速为0.8 mL/min，检测波长为294 nm，柱温为20 ℃，进样量为20 μL，洗脱程序见表1。采用外标法定量。

表1 梯度洗脱条件

2.2 线性试验

分别精密量取 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL浓度的标准工作液20 μL，按照2.1液相色谱条件，进行分析，每个浓度进样3次。分别以芬苯达唑、芬苯达唑砜和奥芬达唑的工作液浓度为横坐标，色谱响应值峰面积为纵坐标做标准曲线，进行线性统计分析。

2.3 样品净化

称量匀浆鸡肉样品2 g，加入无水硫酸钠2 g，再加入含10%二甲基亚砜的乙酸乙酯10 mL，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，取上清9 mL；重复提取，合并上清。上清液用45 ℃水浴旋蒸浓缩至干，再用3 mL 1mol/L磷酸分三次溶解残渣，合并磷酸溶液。向磷酸溶液中加入8 mL正己烷去脂，涡旋1 min，使其充分混合，4 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷，再加入8 mL正己烷重复上述操作，合并磷酸溶液，备用。

将上述磷酸溶液加入已活化好的C18柱，待其完全通过C18柱后，用5 mL 5%甲醇、5 mL 30%甲醇依次淋洗，最后用2 mL甲醇洗脱。然后40 ℃氮气吹干洗脱液，0.5 mL流动相复溶，过滤，液相色谱-紫外检测分析。

C18固相萃取小柱活化：先加入5 mL甲醇，再加入5 mL水。

2.4 添加回收率试验

设1、5、25 μg/kg三个添加水平，在2 g空白鸡肉中分别添加0.02、0.10、0.50 μg/mL芬苯达唑、芬苯达唑砜和奥芬达唑标准品混合工作液100 μL，常温振荡1 h，使空白鸡肉组织浓度分别为1、5、25 μg/kg，按照方法2.3处理添加样品，方法 2.1进行液相色谱-紫外检测分析。然后对照各自标准曲线，计算回收率；同一天重复测定3次，计算日内变异系数；连续测定3 d，计算日间变异系数。

3 结果与分析

3.1 线性试验

在0.02～0.50 μg/mL范围内，芬苯达唑、芬苯达唑砜和奥芬达唑的线性回归方程及其相关系数如表2所示。由表可知，三个化合物的相关系数均在0.999以上，线性良好。

表2 回归方程及其相关系数

3.2 灵敏度

在空白鸡肉组织中添加1 μg/kg芬苯达唑、芬苯达唑砜和奥芬达唑时，其信噪比均大于10，如图2所示。

图2 空白鸡肉组织中添加1 μg·kg-1标准物质色谱图

3.3 回收率及精密度

在1～25 μg/kg范围内，芬苯达唑、芬苯达唑砜和奥芬达唑的回收率为77.9～96.6%，日内变异系数为 3.10～6.81%（n＝3），日间变异系数为1.19～7.74%（n＝3），如表3所示。

表3 芬苯咪唑类药物及其代谢物的回收率和灵敏度

4 讨论

4.1 前处理方法

本试验分别采用乙腈、碱化乙腈[14]、酸化乙腈[8]、乙酸乙酯和含二甲基亚砜的乙酸乙酯提取鸡肉中芬苯达唑及其代谢物，试验结果表明使用乙腈、碱化乙腈、酸化乙腈和乙酸乙酯提取杂质峰过多，且回收率不高，含二甲基亚砜的乙酸乙酯回收率高，目标峰处没有明显杂质峰，所以选取含二甲基亚砜的乙酸乙酯作为提取试剂。然后对使用不同量的提取试剂提取进行试验，结果表明采用10 mL提取试剂重复提取两次回收率最高，在 70%以上。在提取过程同时，在样品中加入无水硫酸钠，形成液液分区，提高了提取效率。

4.2 液相色谱检测

液相色谱方法虽不及液质灵敏度高，但是液相色谱方法适合于基层使用。另外，以往检测苯并咪唑的方法通常是检测苯并咪唑类药物残留的方法，而本文采用检测芬苯达唑及其代谢物的方法，使残留检测更加合理。

4.3 流动相选择

本文比较了甲醇和乙腈作为有机相，发现在其他条件相同的情况下，用甲醇作为流动相，峰比较复杂，杂峰与药物的目标峰无法分开；采用乙腈作为有机相，则可以与药物的目标峰分开。此外，比较了纯水和醋酸铵及醋酸。发现醋酸铵作为水相，芬苯达唑及其代谢物的杂峰最少，且检测限最低。这可能是由于芬苯达唑属于弱碱性，在弱碱性的流动相中不宜解离。