莲雾果醋发酵菌种的筛选及条件优化

方晓纯 ，林波，兰亚龙，郑凤锦 ，陈赶林

1. 广西农业科学院农产品加工研究所（南宁 530007）；2. 广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室（南宁 530007）；3. 陕西易腾达酿造科技有限公司（宝鸡 721013）

莲雾（Syzygium Samarangense），又名水蒲桃、洋蒲桃、爪哇蒲桃等，在我国台湾、海南、广东、广西、福建、云南等多省（区）有栽培[1]，是海南重要的热带水果，有黑金刚、黑珍珠、红宝石等主要品种。莲雾果实呈圆锥形，像铃铛，果皮有乳白、青绿、粉红以至深红色，具有清香气味，肉质细腻，清甜爽口。近年来诸多学者对莲雾进行多方面的研究，更加验证莲雾具有较高的营养价值和药用保健等功能[2]。王晓红[3]测定莲雾果肉的营养成分，结果发现莲雾富含蛋白质，糖类，维生素B1、B2、B6、C，钾、钠、钙、磷、铁、镁等矿物质，给予人们清凉解渴的同时能补充营养，再加上其热量低，深受消费者喜爱。邓博一等[4]发现莲雾果实富含17种氨基酸，包括人体必需的7种氨基酸；其果皮中有大量花色苷和花青素，具有抗炎镇痛、抗癌、抗氧化等功效；莲雾花中含有多酚成分，具有较强的体外抗氧化活性[5]。莲雾水分高，果肉组织娇嫩，呼吸旺盛不耐贮藏，其种植面积逐年增大，逐步打开国内水果市场[6]，为避免鲜果滞销后浪费，掌握莲雾的深加工迫在眉睫。

果醋是利用水果、蔬菜或者发酵后的果酒[7]为原料，利用微生物或醋酸菌的代谢作用发酵而成的一种具有促进消化、增强免疫、抑菌等功能的健康发酵食品[8]。李志春等[9]通过高脂小鼠试验表明，甘蔗醋中含有黄酮和多酚类活性物质成分，具有降血脂、提高抗氧化应激、减轻体重和脏器肿大等生物功能。另外，因微生物在发酵成醋的过程中对矿物质的需求和利用较少，所以水果中大部分矿物质会直接保留在果醋中[10]。近年来我国提倡不同果醋的研究开发，明显丰富果醋的种类，技术研究趋于成熟稳定，市场上苹果醋[11]、葡萄醋[12]、山楂醋[13]等成功的果醋产品为新型果醋的开发打下坚实基础[14]。

莲雾具有丰富的糖质资源和水分，是酿醋用的上等原料，莲雾醋的生产能解决鲜果滞销和残次果的有效利用，但针对于莲雾醋发酵菌种筛选及工艺优化的相关研究报道鲜为少见。试验主要选用5种商业醋酸菌种发酵莲雾醋，以醋酸质量浓度及感官评分为考察指标，筛选出适合莲雾醋发酵的醋酸菌种，在此最优菌种基础上进行单因素试验和正交试验，优化莲雾醋的工艺条件，以期得到色泽明亮、醋味清香的莲雾果醋，为莲雾产业深加工及多元化利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲雾果酒（广西农业科学院农产品加工研究所研发制备）；LB活性醋酸菌（简称LB，陕西鼎力生物科技有限公司）；沪酿1.01号活性醋酸菌（简称沪酿1.01，上海佳民酿造食品有限公司）；帝伯仕果醋菌（简称帝伯仕，山东烟台帝伯仕自酿机有限公司）；迪发牌醋酸菌（简称迪发牌，上海迪发酿造生物制品有限公司）；拉曼德果醋菌（简称拉曼德，山东日照隆堡商贸有限公司）；白砂糖（南宁糖业股份有限公司）。试验所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

恒温生物培养箱（Salvis LAB CN118，瑞士Salvis公司）；糖度计[PAL-1，日本ATAGO（爱拓）公司]；电子天平（JA2003型，上海良平仪器仪表有限公司）；pH计（上海雷磁仪器厂）；高压灭菌锅（FY-65L，上海申安有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 莲雾醋酿造工艺流程

1.3.2 莲雾果酒的制备

将新鲜、干净的莲雾果实通过打浆机打成浆状，添加果胶酶酶解，加入适量白砂糖调节糖度，灭菌后冷却至室温，加入活化过的果酒酵母进行酒精发酵，过滤后得到莲雾果酒，具体制备方法见前期研究[7]。

1.3.3 莲雾醋发酵菌种的筛选

选择已活化LB、沪酿1.01号、帝伯仕、迪发牌和拉曼德的醋酸菌种，依次发酵同一批次的莲雾果酒（底酸含量1.6 g/L，pH 4.01，可溶性固形物5.5%），在初始酒精度6%vol、菌种添加量0.5%、发酵温度30 ℃条件下进行醋酸发酵11 d，隔天取样测定其pH和总酸含量，发酵结束后过滤，并进行感官评定。以醋酸质量浓度（以乙酸计，g/L）及感官评分为考察指标，确定适合莲雾醋发酵的最佳菌种。

1.3.4 菌种添加量对莲雾醋发酵的影响

莲雾果酒初始酒精度6%vol，加糖量4%，选取优化醋酸菌种（迪发牌醋酸菌），菌种添加量分别为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%，发酵温度30 ℃，进行9 d的醋酸发酵，以总酸含量和残留酒精度为考察指标，分析不同菌种添加量对莲雾醋发酵的影响。

1.3.5 初始酒精度对莲雾醋发酵的影响

加入无菌水稀释莲雾果酒，将酒精度调配至3%vol，4%vol，5%vol，6%vol和7%vol，在加糖量4%、菌种添加量0.4%、发酵温度30 ℃条件下进行9 d的醋酸发酵，以总酸含量和残留酒精度为考察指标，分析不同初始酒精度对莲雾醋发酵的影响。

1.3.6 发酵温度对莲雾醋发酵的影响

莲雾果酒初始酒精度6%vol，加糖量4%，菌种添加量0.4%，分别在发酵温度25，28，31，34和37 ℃条件下进行9 d的醋酸发酵，以总酸含量和酒精残留量为考察指标，分析不同发酵温度对莲雾醋发酵的影响。

1.3.7 加糖量对莲雾醋发酵的影响

莲雾果酒初始酒精度6%vol，菌种添加量0.4%，发酵温度30 ℃，白砂糖添加量分别为2%，3%，4%，5%，6%和7%，进行11 d的醋酸发酵，以总酸含量和残留酒精度为考察指标，分析不同加糖量对莲雾醋发酵的影响。

1.3.8 正交试验设计

在单因素试验基础上，选择菌种添加量、初始酒精度、发酵温度和加糖量为自变量，以总酸含量为考察指标，进行L16(45)正交试验，考察各因素对莲雾醋发酵的影响，正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.4 测定方法

总酸测定，采用酸碱滴定法，按GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》操作，总酸含量以醋酸表示；酒精度测定，按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法测定；pH测定，pH计法；微生物检测，按GB/T 4789.22—2003《食品卫生微生物学检验调味品检验》中的方法测定。

感官评分由11人组成评定小组，从色泽、香气、滋味和形态4个方面对样品进行评分，感官评定标准[15]如表2所示。

表2 感官评定表

1.5 数据分析方法

数据处理及作图采用Excel 2019。

2 结果与分析

2.1 莲雾醋酿造菌种的筛选

在果醋发酵过程中，菌种是影响果醋品质的重要因素之一，不同醋酸菌发酵果醋，其风味不相同，产酸能力也会有所差别。由图1和表3可知，5种醋酸菌发酵莲雾醋产酸差异较大，其中LB、帝伯仕和拉曼德3个醋酸菌发酵启动慢，酸度变化趋势不明显，且感官评分也较低。迪发牌醋酸菌和沪酿1.01号醋酸菌随着时间的增加总酸含量不断上升，发酵至9 d，其总酸含量分别为8.9 g/L和7.0 g/L，感官评分分别为88分和80分。迪发牌醋酸菌的发酵液表面长有一层薄的白色醋膜，醋香味明显，爽口，醋液浅黄色透亮；LB、帝伯仕和拉曼德醋酸菌的发酵液无醋香味，酒精味明显，所以评分低，沪酿1.01醋酸菌的发酵液虽然产酸能力强，但醋香味不够浓，入口协调性不够，醋体颜色较浑浊。综合产酸量和感官评价，最终选定适合发酵莲雾醋的最佳菌种是迪发牌醋酸菌，这与朴银子等[16]在蓝莓果醋发酵工艺条件优化使用的菌种一致，表明该菌种适用于果醋酿造。

图1 不同菌种发酵莲雾醋对总酸含量的影响

表3 不同菌种发酵后莲雾醋的感官评分

2.2 影响莲雾醋醋酸发酵的因素

2.2.1 菌种添加量对莲雾醋发酵的影响

由图2可知，随着时间的延长，接种量1.0%发酵液的发酵最为显著，发酵3 d后其总酸含量达4.44 g/L，但发酵5 d后，产酸量逐渐低于接种量0.8%发酵液的产酸量。接种量0.8%发酵液的总酸含量随着时间延长而迅速升高，明显高于其他添加量发酵液的总酸含量，发酵至9 d，接种量0.8%发酵液的总酸含量最高，达24.72 g/L，其次是接种量0.6%发酵液，总酸含量为22.98 g/L。接种量0.2%发酵液的发酵启动最慢，且总酸含量也最低。由图3可知，菌种添加量越少，发酵过程不充分，醋酸菌代谢产酸越慢，伴随酒精残留量也越高。菌种添加量若越大，醋酸菌菌体细胞会迅速增殖，导致醋酸菌细胞提前老化和衰退。菌种添加量的多少直接影响醋酸发酵的产酸速率[17]。因此发酵莲雾醋选择菌种添加量0.4%~1.0%为宜。

图2 不同接种量发酵莲雾醋对总酸的影响

图3 不同菌种添加量的酒精残留量图

2.2.2 初始酒精度对莲雾醋发酵的影响

醋酸菌对酒精具有一定的耐受性，低酒精度下有利于产酸，但初始酒精度较高情况下（10%vol以上）会抑制醋酸菌活性和延滞产酸稳定期，产酸量降低[18]，而酒精度过低又易受杂菌污染，因此研究选择3%vol~7%vol为初始酒精度发酵莲雾醋。由图4可知，不同初始酒精度发酵莲雾醋，产酸量有明显区别，2 d后醋酸菌进入生长期，发酵启动最快的是初始酒精度3%vol的发酵液，发酵至9 d，其总酸含量最高，为27.0 g/L，其次是4%vol的发酵液，而初始酒精度6%vol和7%vol的发酵液产酸较慢，表现为曲线平缓，在发酵前期，醋酸菌生长繁殖会因酒精度过高而受到抑制，使产酸量降低，还会使发酵周期延长[19]。由图5可知，初始酒精度越高，醋酸发酵后残留的酒精度越大，其中初始酒精度3%vol的酒精残留量最小，为0.5%vol，初始酒精度7%vol的酒精残留量最大，为3.9%vol，酒精残留量高影响果醋的口感[20]。因此初始酒精度选择3%vol~5%vol的浓度较适宜。

图4 不同初始酒精度发酵莲雾醋对总酸的影响

2.2.3 温度对莲雾醋发酵的影响

由图6可知，不同温度发酵莲雾醋总酸含量变化明显，发酵前2 d各发酵液产酸较缓慢，从第3天开始菌种迅速进入对数期，随着发酵时间的增加，各发酵液产酸量不断增加，其中28 ℃和25 ℃的发酵液总酸含量上升最明显。发酵9 d时，不同温度发酵的总酸含量高低依次为28 ℃＞25 ℃＞31 ℃＞34 ℃＞37 ℃。37 ℃发酵液的总酸含量最低，仅有11.0 g/L，表明此发酵温度不适宜醋酸菌产酸，与何宇宁等[21]菠萝蜜果醋发酵工艺研究中，发酵温度在25~31 ℃产酸量随着温度升高而升高，超过31 ℃时，产酸量逐渐下降的现象一致。发酵温度过高，不适宜醋酸菌代谢转化酒精，可能是因为高温抑制乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶活性，降低乙醇氧化成醋酸的速率[22]，而导致酒精残留量高。由图7可知，34~37 ℃残留的酒精含量较大，其次是31 ℃。因此选择发酵温度25~31 ℃为宜。

图6 不同温度对发酵莲雾醋总酸的影响

图7 不同发酵温度的酒精残留量图

2.2.4 加糖量对莲雾醋发酵的影响

醋酸菌需要利用发酵液中的碳源、氮源和其他营养物质代谢产酸，虽然乙醇是醋酸菌利用最主要的碳源，但是醋酸菌会利用乙醇进行生长繁殖，产物浓度降低[23]，需要在发酵前添加适量的白砂糖作为碳源补给菌种增殖所需的营养，从而减少对酒精的消耗，促进酒精转化率的提高[24]。

由图8可知，发酵前4 d，不同加糖量发酵莲雾醋的总酸变化均不明显，总酸增加缓慢，发酵5 d后加糖量3%和4%的发酵液总酸逐渐增加，发酵7 d后，加糖量4%发酵液的总酸含量迅速增加，发酵至11 d，其总酸含量达29.1 g/L，其次是加糖量3%发酵液，为24.9 g/L；总酸含量最低的是加糖量2%发酵液，表明加糖量过低，发酵液里供菌种生长繁殖的营养太少，不利于代谢产酸。发酵时间延长，可能与白砂糖属于低聚糖，需要进一步降解才能使用有关[25]。由图9可知，加糖量2%~4%时，残留酒精度呈下降趋势，加糖量4%~7%时，残留酒精度呈上升趋势。过高的糖度会产生较大的渗透压，抑制醋酸菌的正常生长代谢产酸，对发酵起抑制作用，导致酒精转化率低，残留酒精多[23]。因此选择加糖量3%~6%为宜。

图8 不同加糖量发酵莲雾果醋对总酸的影响

2.3 优化醋酸发酵的正交试验

在对醋酸发酵条件影响因素分析的基础上，以迪发牌醋酸菌发酵莲雾果醋工艺中的不同菌种添加量、初始酒精度、发酵温度和加糖量这4个关键因数利用正交设计软件助手Ⅱ软件进行L16(45)正交试验。正交试验结果见表4。

表4 优化醋酸发酵工艺条件的正交试验结果

如表4所示，由于空白样的极差值最小，所以试验结果较可靠。由极差分析得出，影响莲雾醋醋酸发酵的因素大小顺序依次为发酵温度（RC）＞初始酒精度（RB）＞加糖量（RD）＞菌种添加量（RA），发酵温度是影响莲雾醋总酸含量的主要因素。由表5方差分析结果可知，发酵温度对莲雾醋产酸影响最大，达到显著的程度，而初始酒精度、加糖量对莲雾醋产酸影响次之，菌种添加量莲雾醋产酸影响程度不显著。发酵工艺最优组合为C2D4B1A3，即发酵温度28 ℃，加糖量6%，初始酒精度3%vol，菌种添加量0.8%。在此条件下发酵9 d，总酸含量最高，达34.1 g/L。

表5 莲雾醋方差分析结果

2.4 产品质量指标分析

2.4.1 感官指标

外观与色泽：浅黄色液体，无悬浮沉淀物。香味：具有莲雾特有的清香，醋酸香气浓郁，口感协调无异味。该果醋感官指标符合GB/T 18187—2000《酿造食醋》中要求。

2.4.2 理化指标

测得莲雾醋总酸含量34.1 g/L，符合GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》中总酸要求。

2.4.3 微生物指标

菌落总数≤100 CFU/mL，大肠菌群≤3 CFU/mL，致病菌未检出。微生物指标均符合GB 2719—2018《食品安全国家标准 食醋》中的要求。

3 结论

以海南黑珍珠莲雾发酵的莲雾果酒为原料，对莲雾果醋发酵的醋酸菌种进行筛选及发酵进行工艺优化研究。结果表明：发酵莲雾醋最适醋酸菌种为迪发牌醋酸菌、菌种添加量0.8%、初始酒精度3%vol、发酵温度28 ℃、加糖量6%，在此最优条件下静态发酵9 d，总酸含量34.1 g/L，得到的莲雾醋感官、理化和微生物指标均符合国家标准，醋体浅黄透亮，醋味浓郁略带清香果味，酸甜爽口，风味独特。