电针大鼠血清对氧糖剥夺诱导的海马神经元铁死亡的影响

李笑笑 ，李姝洁 ，董健健 ，韩永升，

1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012； 2.安徽中医药大学神经病学研究所，安徽 合肥 230038；3.安徽省中西医结合医院，安徽 合肥 230031

卒中是世界第二大死亡原因，也是全球致残的主要原因。缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是卒中最常见的类型[1-2]，由血管阻塞导致大脑特定区域血液供应减少引起。电针将传统针刺与生物电刺激相结合，基础和临床研究均表明电针可通过多途径、多靶点治疗IS[3-6]。针刺血清是针刺治疗后产生的效应物质，有类似于针刺治疗的效应，具有抑制神经元Ca2+超载、促进神经干细胞增殖与分化、上调神经元内质网活性、提高海马神经元突触可塑性、减轻神经元损伤等作用[7-10]。

铁死亡是细胞内铁和脂质活性氧累积，导致细胞氧化应激损伤和死亡的特殊死亡形式[11]。越来越多的证据表明，铁死亡是IS病理性细胞死亡的重要机制，铁死亡促进IS的发生，引起脑组织结构和功能损伤，而抑制铁死亡可以显著降低IS严重程度并促进脑功能恢复[12-13]。

课题组前期研究发现，电针对IS模型大鼠神经血管单元（NVU）具有保护作用，且电针血清干预可减轻氧糖剥夺/复糖复氧（OGD/R）诱导的神经元损伤，而该作用与激活Wnt/β-catenin信号通路密切相关[14-15]。同时发现，电针通过抑制铁死亡对IS模型大鼠发挥神经保护作用[16]。为进一步探究电针对IS铁死亡的抑制作用及可能机制，本研究利用OGD/R方法构建海马神经元体外缺血损伤模型，并予电针大鼠血清干预，观察电针血清对海马神经元OGD/R损伤及铁死亡的影响，为电针治疗IS提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物及细胞

SPF级健康雄性SD大鼠30只，2～3月龄，体质量250～300 g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物许可证号SCXK（鲁）2019-0003。饲养温度24～26 ℃，相对湿度50%～60%，12 h光照，自由摄食饮水。HT-22细胞，购自中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养基（批号8120475），美国Gibco公司；胎牛血清（批号20210506），天津康源；CCK8试剂盒（批号CK04），上海东仁化学科技有限公司；活性氧（ROS）检测试剂盒（批号CA1410），索莱宝科技有限公司；长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）抗体（批号384265）、Wnt1多克隆抗体（批号251822），成都正能生物；β-连环蛋白（β-catenin）多克隆抗体（批号8480），美国CST公司；谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗体（批号GB113745），武汉赛维尔生物；糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）抗体（批号ab32391）、轴蛋白2（Axin2）抗体（批号ab109307）、运铁蛋白（Tf）抗体（批号ab82411），英国Abcam公司。

生物安全柜（BSC-1300ⅡA2），苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱（GOLD-SIM W200IR），美国SIM公司；荧光倒置相差显微镜（CKX41），日本Olympus公司；全波长酶标仪（Epoch2），美国Biotek公司；电泳仪（Powerpac Basic），美国伯乐公司；电针仪（G6805-2A），上海华谊医用仪器有限公司；一次性无菌针灸针（13 mm×0.18 mm），吴江云龙医疗器械有限公司。

2 实验方法

2.1 血清制备

参照前期研究[15]方法制备对照大鼠血清和电针大鼠血清，0.22 μm过滤器过滤，分装，56 ℃灭活30 min，-20 ℃冰箱保存备用。

2.2 分组、造模及干预

将HT-22细胞分为对照组、模型组和电针血清组。对照组先以15%对照大鼠血清置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，后更换为无血清、含糖培养基继续培养；模型组先以15%对照大鼠血清正常培养24 h，再以无血清、无糖培养基置于37 ℃、5%CO2、1%O2和94%N2混合气体培养箱中培养2 h，后以无血清、含糖培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h建立OGD/R模型；电针血清组先以15%电针大鼠血清正常培养24 h，再按模型组方法进行处理。

2.3 CCK8法检测细胞存活率

取对数生长期细胞，以每孔1×105个细胞接种至96孔板，每孔100 μL，按“2.2”项下方法分组处理，每组6个复孔，另设空白组（不接种细胞仅加入培养基）。干预结束后，每孔加入10 μL CCK8溶液，于37 ℃培养箱中孵育1.5 h，各组分别吸取100 μL培养液于96孔板中，酶标仪波长450 nm测定吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（电针血清组-空白组）÷（对照组-空白组）×100%。

2.4 活性氧含量检测

取对数生长期细胞，将细胞接种至放有细胞爬片的6孔板中，调整细胞密度为3×105个/孔，并按“2.2”项下方法进行分组干预。干预结束后，吸去培养液，每孔加入1 mL稀释的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，弃去液体，以无血清培养基洗涤细胞3次，细胞爬片滴加DAPI染色剂，室温避光孵育8～10 min，PBS漂洗3次，使用抗荧光淬灭封片剂进行封片，荧光显微镜下观察，使用Image J软件分析平均荧光强度。

2.5 Western blot检测

干预结束后，收集各组细胞，分别加入PMSF和RIPA裂解液吹打混合，冰浴摇床上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴加热8 min，-80 ℃冰箱保存备用。以12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移到NC膜上，快速封闭液摇床常温封闭20 min，加入β-actin、ACSL4、 Tf、 GPX4、 Wnt1、 β -catenin、 Axin2、GSK-3β一抗（均为1∶1 000），室温摇床孵育4 h，PBST洗膜3次，加二抗（1∶10 000），室温摇床孵育1.5 h，使用ECL发光试剂进行曝光，Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值比值计算蛋白相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS23.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 电针血清对HT-22细胞存活率的影响

与对照组比较，模型组HT-22细胞存活率显著降低（P<0.01）；与模型组比较，电针血清组HT-22细胞存活率显著升高（P<0.01）。见表1。

表1 各组HT-22细胞存活率比较（±s，%）

表1 各组HT-22细胞存活率比较（±s，%）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组电针血清组n 6 6 6存活率100.00± 5.37 56.04± 6.81**71.87±10.05##

4.2 电针血清对HT-22细胞活性氧含量的影响

与对照组比较，模型组HT-22细胞ROS含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，电针血清组HT-22细胞ROS含量显著减少（P<0.01）。见表2。

表2 各组HT-22细胞ROS含量比较（±s，平均荧光强度）

表2 各组HT-22细胞ROS含量比较（±s，平均荧光强度）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组电针血清组n 3 3 3 ROS 2.04±0.37 44.59±2.47**17.59±2.08##

4.3 电针血清对HT-22细胞铁死亡相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组HT-22细胞ACSL4、Tf蛋白表达升高，GPX4蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，电针血清组HT-22细胞ACSL4、Tf蛋白表达降低，GPX4蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1、表3。

图1 各组HT-22细胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白免疫印迹

表3 各组HT-22细胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白表达比较（±s）

表3 各组HT-22细胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组电针血清组n 3 3 3 ACSL4 0.141±0.003 0.316±0.002**0.096±0.003##Tf 0.635±0.006 0.665±0.004**0.383±0.002##GPX4 1.021±0.013 0.500±0.009**0.643±0.001##

4.4 电针血清对HT-22细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组HT-22细胞Wnt1、β-catenin蛋白表达显著降低，Axin2、GSK-3β蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，电针血清组HT-22细胞Wnt1、β-catenin蛋白表达显著升高，Axin2、GSK-3β蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表4、图2。

图2 各组HT-22细胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白免疫印迹

表4 各组HT-22细胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白表达比较（±s）

表4 各组HT-22细胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

组别对照组模型组电针血清组n 3 3 3 Wnt1 0.639±0.015 0.524±0.008**0.612±0.010##β-catenin 1.024±0.028 0.846±0.014**0.986±0.033##Axin2 0.649±0.012 0.878±0.013**0.662±0.020##GSK-3β 0.633±0.017 0.787±0.018**0.599±0.021##

5 讨论

研究发现，以铁超载、谷胱甘肽（GSH）消耗和GPX4失活、脂质过氧化、Xc-系统损伤及线粒体膜密度增加、嵴破裂或消失等为特征的铁死亡在IS发生发展中具有重要作用[17]。大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠大脑皮质出现铁和ROS沉积，血清脂质过氧化水平明显升高，并伴有铁死亡相关蛋白表达异常[18]。OGD/R能显著增加神经元内铁和ROS含量，线粒体出现膜密度增加和嵴减少[19]，而应用铁死亡抑制剂如Liproxstatin-1可显著减少铁沉积和ROS生成，降低脂质过氧化水平，保护OGD/R诱导的神经元损伤，促进MCAO大鼠神经功能恢复[20]。临床应用去铁胺能降低急性IS患者体内铁含量和运铁蛋白饱和度，减轻神经损伤，改善预后[21]。

ROS累积是铁死亡的标志之一，铁死亡抑制剂和各种抗氧化剂或ROS清除剂都可以抑制ROS累积和细胞铁死亡[22]。相关研究发现，OGD/R诱导神经元内铁和ROS沉积，介导细胞铁死亡[20，23-24]。本实验及前期研究结果[14]显示，OGD/R后神经元内ROS水平升高、丙二醛（MDA）含量增加、超氧化物歧化酶（SOD）活性减弱，提示OGD/R诱导神经元内ROS生成和氧化应激发生。在电针大鼠血清干预下，ROS水平降低，MDA含量减少、SOD活性增强，提示电针大鼠血清能抑制ROS产生，减轻氧化损伤。

ACSL4和GPX4被认为是铁死亡的正、负调节因子。ACSL4是多不饱和脂肪酸（PUFA）代谢的同工酶[25]，通过催化PUFA乙酰化，产生脂质过氧化物，导致铁死亡[26]。ACSL4过表达促进铁死亡的发生，而抑制ACSL4可减轻铁死亡[27-28]。GPX4是一种硒过氧化物酶，利用GSH作为辅助因子，将有毒的脂质氢过氧化物转化为无毒的脂质醇，以维持细胞氧化还原稳态[29]，通过调节脂质过氧化抑制细胞铁死亡。Tf是血清中的一种铁载体蛋白，通过转铁蛋白受体介导的内吞作用将铁转运到细胞中[30]，Tf的激活促进铁死亡发生[31]。本实验发现，OGD/R诱导HT-22细胞ACSL4、Tf蛋白表达升高，GPX4蛋白表达降低，结合ROS含量增加和细胞存活率降低，提示OGD/R能诱导神经元铁死亡。电针血清干预后，HT-22细胞ACSL4、Tf蛋白表达降低，GPX4蛋白表达升高，并伴有ROS含量减少和细胞存活率升高，提示电针血清对OGD/R诱导的神经元铁死亡具有抑制作用。

Wnt信号通路是一条进化上保守的细胞间信息传递通路，与胚胎发生和干细胞更新，细胞增殖、分化等紧密相关。课题组前期研究发现，电针可通过激活Wnt/β-catenin信号通路，有效保护MCAO大鼠NVU[14]。本研究也发现，在电针大鼠血清干预后，HT-22细胞Wnt1、β-catenin蛋白表达上调，Axin2、GSK-3β蛋白表达下调，提示电针大鼠血清可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制神经元铁死亡。

综上所述，电针大鼠血清对OGD/R诱导的海马神经元损伤的保护作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制细胞铁死亡相关。