黄芪对糖尿病视网膜病变小鼠的影响及机制研究

刘汉滢 ，季青璇 ，彭美中 ，马盼 ，牛艺婷 ，徐艺宸 ，韩静

1.北京中医药大学中医学院，北京 100029； 2.北京中医药大学北京中医药研究院，北京 100029

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病引起的微血管并发症[1]，是成年人失明最常见的原因[2]。在我国，随着糖尿病患病人数增加，DR的致盲率日益升高[3]。目前，DR的治疗方法有控制血糖、激光光凝手术、注射抗血管内皮生长因子药物等。但目前的治疗方法存在弊端，如经视网膜光凝手术治疗后，患者出现视网膜受损性裂孔、虹膜受损、出血等不良反应[4]；使用抗血管内皮生长因子药物治疗后，部分患者出现牵引性视网膜脱离、眼压升高、黄斑孔形成及葡萄膜炎等不良反应[5]。因此，亟需寻找能够有效治疗DR的新方法。

黄芪味甘，性微温，具有补气升阳、固表止汗、敛疮生肌等作用[6]。药理研究表明，黄芪可降低糖尿病大鼠血糖[7]。临床研究表明，黄芪注射液能提高DR患者视力，减少眼底出血，改善血液流变学指标[8]。此外，黄芪有效部位黄芪多糖能减少视网膜血管中白细胞黏附，降低DR大鼠视网膜肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等蛋白表达[9]。黄芪主要成分黄芪甲苷可显著抑制db/db小鼠视网膜神经节细胞凋亡[10]。虽然提示黄芪具有治疗DR的潜力，但药理机制尚未阐明。本实验通过建立小鼠糖尿病模型，观察黄芪对糖尿病小鼠视网膜病变的作用，并探讨其潜在机制，为黄芪治疗DR的临床应用奠定基础。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠18只，8周龄，体质量20～25 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号SYXK（京）2019-0030。饲养于北京中医药大学动物实验中心，温度22～27 ℃，湿度45%～55%，自然光照，适应性喂养1周。本实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（BUCM-4-2020102005-4193）。

1.2 药物及制备

黄芪，购于南京同仁堂有限公司，批号6971133498764。称取黄芪饮片50 g，加10倍量去离子水，煎煮2次，每次2 h，合并滤液，减压浓缩至5 g/mL，于4 ℃保存。

1.3 主要试剂与仪器

链脲佐菌素（STZ），德国Sigma，货号S0130；柠檬酸钠缓冲液，江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGHC001；封闭用羊血清，北京中杉金桥，货号ZLI-9056；小鼠内皮糖蛋白（Endoglin/CD105）抗体，英国Abcam，货号ab156756；基质金属蛋白酶2（MMP2）抗体，英国Abcam，货号ab79781；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）抗体，美国CST，货号D5C5Z；含DAPI荧光封片剂，北京中杉金桥，货号ZF-0311；山羊抗小鼠IgG，英国Abcam，货号ab97018；羊抗兔IgG-Alexa Fluor 647，北京百瑞极生物，货号BN20636；Triton X-100，北京百瑞极生物，货号9002-93-1。光学显微镜（德国Leica，型号DM2500），激光共聚焦显微镜（德国Leica，型号TCS SP8），视网膜显微成像系统（美国Phoenix Research Labs，型号Micron Ⅲ）。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

小鼠随机分为正常组、模型组和黄芪组，每组6只。除正常组外，其余各组参照文献[11]方法制备DR小鼠模型。小鼠禁食12 h，模型组和黄芪组连续5 d腹腔注射链脲佐菌素溶液60 mg/kg（pH=4.4柠檬酸钠缓冲液配制），正常组注射等体积柠檬酸钠缓冲液。4周后小鼠尾静脉采血测定空腹6 h血糖，剔除血糖<16.7 mmol/L小鼠。按60 kg成人临床剂量与小鼠体表面积换算给药剂量，黄芪组予黄芪水提物80 mg/kg灌胃[12-13]，正常组和模型组予等体积羧甲基纤维素钠灌胃，连续6周。

2.2 体质量与空腹血糖测定

每周称量小鼠体质量，每2周检测小鼠空腹血糖。

2.3 光学相干断层扫描检测视网膜厚度

小鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥钠麻醉，滴加复方托吡卡胺滴眼液散瞳，卡波姆眼膏润滑角膜，将小鼠眼球紧贴于实验仪器镜面进行观察并拍照。采用Image J软件对图片进行分析，统一标尺长度以测量视网膜厚度，以中央凹为起点，在左右各150、300 μm处测量视网膜全层厚度。

2.4 网络药理学分析

2.4.1 黄芪有效成分及靶点筛选

在 TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库以“黄芪”为关键词进行检索，获取黄芪有效成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选。通过SwissTargetPrediction数据库检索有效成分对应靶点信息，将筛选的靶点导入UniProt数据库（http://www.uniprot.org/up-loadlists/），限定物种为“人类”，将靶点蛋白、基因信息标准化。

2.4.2 糖尿病视网膜病变相关靶点筛选

以“diabetic retinopathy”为关键词在OMIM（https://www.omim.org/）、GAD（https://www.g6gsoftwaredirectory.com/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库进行检索，获得DR相关靶点。

2.4.3 黄芪治疗糖尿病视网膜病变靶点预测

将黄芪有效成分靶点与DR相关靶点导入Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到交集靶点，即黄芪治疗DR的潜在靶点。

2.4.4 蛋白相互作用网络构建

将获得的交集靶点导入STRING（https://cn.stringdb.org/）数据库，物种设置为“人类”，剔除孤立靶点，以TSV格式将数据导出，得到蛋白相互作用（PPI）网络，并进行蛋白间相互作用分析。

2.4.5 黄芪治疗糖尿病视网膜病变靶点生物功能注释

将黄芪治疗DR靶点上传至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/list.jsp）数据库，对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，将阈值P<0.01设定为筛选条件。

2.5 免疫荧光染色

干预结束后，取视网膜，制作视网膜组织切片，依次加入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ浸泡20 min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%）脱水5 min，流水冲洗10 min，甘氨酸溶液孵育10 min，PBS冲洗3次，羊血清封闭30 min，分别滴加CD105一抗（1∶50）、MMP2一抗（1∶200）、GSK-3β一抗（1∶250），4 ℃孵育过夜。PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗（1∶400），37 ℃避光孵育60 min，加入适量含DAPI荧光封片剂，避光复染5 min，盖玻片封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照，采用Image J软件分析蛋白平均光密度。

3 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，符合正态分布，多组间比较采用方差分析，方差齐组间两两比较采用LSD法，方差不齐用T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 黄芪对模型小鼠体质量及空腹血糖的影响

与正常组比较，模型组小鼠体质量明显减少（P<0.05），空腹血糖明显升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪组小鼠体质量明显增加（P<0.05），空腹血糖水平无明显变化（P>0.05）。结果见表1。

表1 各组小鼠体质量和空腹血糖比较（±s）

表1 各组小鼠体质量和空腹血糖比较（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别正常组模型组黄芪组只数6 6 6体质量/g 32.25±1.47 20.34±1.15*22.34±1.51#空腹血糖/（mmol/L）8.57±0.73 25.83±2.86*23.17±9.95

4.2 黄芪对模型小鼠视网膜厚度的影响

光学相干断层扫描前麻醉过程中，黄芪组小鼠死亡2只。对视网膜厚度测量后发现，与正常组比较，模型组小鼠距中央凹150、300 μm处视网膜厚度明显减少（P<0.05）；与模型组比较，黄芪组小鼠距中央凹150、300 μm处视网膜厚度明显增加（P<0.05）。结果见图1、表2。

图1 各组小鼠视网膜光学相干断层扫描图像

表2 各组小鼠视网膜厚度比较（±s，μm）

表2 各组小鼠视网膜厚度比较（±s，μm）

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

距中央凹300 μm厚度组别 只数 距中央凹150 μm厚度163.00±4.46 153.52±7.63*158.12±7.53#正常组模型组黄芪组6 6 4 160.67±3.89 151.79±6.81*156.12±7.05#

4.3 黄芪对模型小鼠视网膜组织CD105蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠视网膜组织CD105蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪组小鼠视网膜组织CD105蛋白表达明显降低（P<0.05）。结果见图2、表3。

图2 各组小鼠视网膜组织CD105蛋白表达（免疫荧光染色，×400）

表3 各组小鼠视网膜组织CD105蛋白表达比较（±s，%）

表3 各组小鼠视网膜组织CD105蛋白表达比较（±s，%）

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别正常组模型组黄芪组只数6 6 4平均光密度0.033±0.001 0.039±0.002*0.035±0.001#

4.4 网络药理学分析结果

4.4.1 黄芪有效成分及靶点

通过TCMSP数据库检索，并根据OB≥30%、DL≥0.18筛选，得到黄芪有效成分6个，见表4。通过SwissTargetPrediction数据库检索6个有效成分对应的靶点信息，剔除重复靶点后，得到127个靶点。

表4 黄芪有效成分信息（OB≥30%、DL≥0.18）

4.4.2 糖尿病视网膜病变相关靶点及交集靶点

在OMIM、GAD、TTD 3个数据库检索DR相关靶点，剔除重复靶点后，共获得650个靶点。采用Venny 2.1将有效成分靶点与DR相关靶点取交集，共获得58个交集靶点，韦恩图见图3。

图3 黄芪治疗DR相关靶点韦恩图

4.4.3 蛋白相互作用网络与核心靶点

将58个交集靶点导入STRING数据库，得到PPI网络（见图4）。该网络由58个节点、30条边构成，平均节点数10.6。节点数靠前的靶点包括MMP2、GSK3B、EGFR、IL2、PPARG等。

图4 黄芪治疗DR靶点PPI网络

4.4.4 GO功能和KEGG通路富集分析

将58个交集靶点导入DAVID数据库进行GO富集分析，以P<0.01为筛选条件，选取前20条基因信息绘制条图（见图5）。对交集靶点进行KEGG通路富集分析，共获得81条通路富集结果。根据P值由小到大选取前20条通路绘制气泡图（见图6）。

图5 黄芪治疗DR靶点GO富集分析

图6 黄芪治疗DR靶点KEGG通路富集分析

4.5 黄芪对模型小鼠视网膜组织基质金属蛋白酶2、糖原合成酶激酶-3β蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠视网膜组织MMP2、GSK-3β蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪组小鼠视网膜组织MMP2、GSK-3β蛋白表达明显降低（P<0.05）。结果见图7、图8、表5。

图7 各组小鼠视网膜组织MMP2蛋白表达（免疫荧光染色，×400）

图8 各组小鼠视网膜组织GSK-3β蛋白表达（免疫荧光染色，×400）

表5 各组小鼠视网膜组织MMP2、GSK-3β蛋白表达比较（±s）

表5 各组小鼠视网膜组织MMP2、GSK-3β蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别正常组模型组黄芪组只数6 6 4 MMP2 0.037 5±0.004 0.049 5±0.003*0.038 0±0.001#GSK-3β 0.037 5±0.004 0.045 1±0.002*0.037 7±0.001#

5 讨论

DR属中医学“消渴目病”范畴[14]。刘完素指出，消渴可“变为雀目或内障”（《宣明论方·消渴总论》），《证治要诀》有“三清久之，精血既亏，或目无视”。其基本病机为本虚标实，以气阴两虚为本，瘀血阻络为标，临床上多用益气养阴、活血化瘀法治疗，效果显著[15-16]。黄芪是临床常用补气药，具有补气升阳、生津养血等功效，对糖尿病及DR有一定作用。

CD105是细胞表面跨膜糖蛋白，在增殖的内皮细胞上表达[17]。有研究表明，CD105可参与血管发育，是新生血管形成的主要标志物[18]。新血管生成是DR的临床特征之一，在DR的各阶段，患者血浆CD105水平均明显升高[19]。通过玻璃体注射DL-α-氨基己二酸建立视网膜新生血管疾病模型发现，模型组视网膜CD105表达较正常组明显升高[20]。本研究采用免疫荧光染色检测DR小鼠视网膜组织CD105表达，结果表明，模型组小鼠视网膜组织CD105蛋白表达较正常组明显升高，黄芪组小鼠视网膜组织CD105蛋白表达较模型组明显降低，说明黄芪能抑制新血管生成。

DR早期特征为血-视网膜屏障破坏，这与内皮细胞紧密连接结构破坏密切相关。MMP2是MMPs家族的一员[21]，由内皮细胞分泌[22]，并通过调节细胞外基质Ⅳ型胶原以平衡基质合成与降解，进而在维持细胞完整性和细胞存活之间发挥关键作用[23]。研究表明，抑制MMP2过表达可抑制视网膜毛细血管内皮细胞凋亡[24]。在DR晚期阶段，MMP2能促进新生血管生成[25]，与非糖尿病组比较，患病12周的糖尿病大鼠视网膜MMP2 mRNA水平显著升高[26]。本研究采用网络药理学分析发现，黄芪多个有效成分对应靶点MMP2，采用免疫荧光染色进一步验证，结果表明，模型组小鼠视网膜组织MMP2表达较正常组明显升高，黄芪组小鼠视网膜组织MMP2表达较模型组明显降低，说明黄芪可能通过抑制MMP2表达抑制新血管生成。

DR发病机制与炎症密切相关，GSK-3β被认为是治疗炎症相关疾病的潜在靶点[27]。GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、凋亡、信号传导中发挥重要作用[28]，其能够调节视网膜内皮细胞黏附分子的表达和细胞周期，进一步导致DR内皮功能障碍及血-视网膜屏障破坏[29]。在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中，模型组视网膜组织GSK-3β表达显著升高[30]。本研究网络药理学结果表明，黄芪可调控GSK-3β，并且免疫荧光结果表明，黄芪能下调DR模型小鼠视网膜组织GSK-3β表达，提示黄芪可能通过GSK-3β改善小鼠DR。

综上所述，黄芪对DR有明显改善作用，其机制可能与下调CD105、MMP2、GSK-3β表达，进而抑制新血管生成有关。本研究初步探讨了黄芪防治DR的作用机制，可为临床应用黄芪治疗DR提供实验依据，但未考察不同剂量黄芪的作用效果，今后研究将进一步明确其量效关系。