白念珠菌与角质形成细胞相互作用的研究进展

房晓雅 杨静

(山西医科大学第二临床医学院皮肤性病科,太原 030001)

1 白念珠菌对角质形成细胞的黏附和侵袭

在皮肤念珠菌病中,角质形成细胞(keratinocytes,KC)往往是白念珠菌侵袭表皮的主要靶细胞。白念珠菌可以通过形态转换以及表达黏附素和侵袭素与KC黏附或相互作用,通过分泌相关的蛋白酶直接进入细胞内,或通过与宿主细胞表面相关配体结合诱导内吞作用进入细胞损伤KC。

1.1 磷酸甘油酸突变酶1 (phosphoglycerate mutase 1,Gpm1)

Gpm1作为一种真菌黏附素,介导了真菌的免疫逃逸、黏附、侵袭和定植。Gpm1在于真菌的表面及其胞质中,可以与补体系统的调节因子H因子/H因子结合样蛋白1(FHL1)结合介导补体C3b的降解。Gpm1还可与纤溶酶原结合,在尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPa)作用下,激活的纤溶酶降解宿主细胞外基质蛋白和补体C3b,有助于白念珠菌免疫逃逸[1]。

Crisanto等[2]通过研究发现Gpm1存在于白念珠菌的表面,且参与白念珠菌与KC和内皮细胞的黏附过程。通过对人体细胞外基质蛋白的分析鉴定找到了其配体——玻连蛋白(vitronectin),二者呈剂量依赖性结合。玻连蛋白存在于KC的表面,是细胞外基质的一个组成部分,同时也是末端补体通路的调节因子。Gpm1与KC的黏附是白念珠菌向深层组织侵袭的前提。gpm1Δ/Δ突变菌株与KC的黏附系数明显降低。

1.2 抗原6(antigen 6)

A型白念珠菌(C.albicansA)具有一种特定的抗原,抗原6,它存在于A型白念珠菌细胞壁的甘露聚糖中[3]。早期研究发现,A型念珠菌细胞壁甘露聚糖特异性侧链即抗原6,可以介导其与人口腔颊黏膜上皮细胞的黏附。随后Bramono等[4]用单克隆抗体6筛选抗原6缺陷突变菌株(MY4-24)以及抗原6阳性的亲本菌株(MI012R)通过与人KC共孵育,用扫描电镜观察A型念珠菌细胞壁的抗原6对KC的黏附作用。研究表明,抗原6缺陷突变株的黏附率明显低于抗原6阳性的亲本菌株,表明人KC表面存在与A型念珠菌抗原6结合的相关受体。

1.3 整合素样蛋白

白念珠菌的整合素样蛋白在结构和功能上都与人的β2整合素的α亚基相似(αM和αX,分别被称为CD11b和CD11c)[5]。整合素可以识别Arg-Gly-Asp(RGD)序列;白念珠菌的整合素样蛋白结构与白细胞黏附糖蛋白(β2整合素)结构不同,除了其α亚基可以识别RGD序列外,其自身也含有RGD序列。白念珠菌表面的整合素样蛋白通过识别上皮细胞合成的iC3b分子中的RGD序列介导黏附[6]。 Ollert等[7]通过将白念珠菌分别与多种衍生的含有RGD序列的合成肽以及KC共孵育,合成的多肽RGD和RGDS没有显示出任何抑制作用,仅用PepTite-2000观察到较为显著的抑制作用。

1.4 分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartic proteinase,Saps)

Saps是白念珠菌分泌的一系列蛋白水解酶,由10个成员组成,Sap1-10[8],在黏附和侵袭宿主细胞的过程中发挥着重要作用。Sap1-8经白念珠菌分泌释放到周围的介质中,而Sap9和Sap10都有典型的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)蛋白质C末端共同序列,可与细胞表面结合[9-10]。

早期研究中发现白念珠菌分泌的Sap1-3在皮肤黏膜的感染过程中有显著作用,尽管白念珠菌感染皮肤和口腔黏膜的过程中都表达了相同的SAP,但表达的顺序在黏附和侵袭过程中有所不同。Schaller等[11]通过重组人上皮的口腔念珠菌病体外模型和应用RT-PCR,展示出白念珠菌感染口腔黏膜过程中SAP基因表达的先后顺序(SAP1和SAP3>SAP6>SAP2和SAP8)。随后通过菌株SC5314感染重组人表皮的皮肤念珠菌病体外模型中观察到SAP1和SAP2、SAP8、SAP6、SAP3[12]在皮肤念珠菌感染过程中的进行性表达。起初观察到浅表KC的病理变化的同时,检测到SAP1和SAP2的表达。当白念珠菌向角质层深部侵袭伴随SAP8的表达。随后当白念珠菌进入棘层和颗粒层并伴随芽管的生成时,可检测到SAP6的表达。Δsap1和Δsap2突变菌株与亲本菌株SC5314的感染相比,两种突变体对组织的损伤显著降低。同样,在该模型中使用特异性天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃抑素A(pepstatin A)后,白念珠菌对KC的黏附和损伤程度大大降低[7],证实了Saps对皮肤损伤的重要作用。

1.5 溶细胞肽毒素(candidalysin)

近年来对于白念珠菌的毒力因子的广泛研究证实了白念珠菌可以分泌一种溶细胞肽毒素,这是一种菌丝衍生的肽毒素,可以直接损伤宿主细胞,并通过双相MAPK调节激活宿主细胞的免疫反应[13]。溶细胞肽毒素由菌丝形成相关基因ECEP1编码, Ece1p被Kex2p[14]和Kex1p(二者均为存在于高尔基体中的蛋白酶)加工为成熟的溶细胞肽毒素。随后验证Ece1-III62-93K是Ece1p的活性区域,Ece1-III浓度累积到一定程度,可与细胞膜相互作用,形成孔状结构,引发细胞膜损伤以及钙离子内流,直接损伤宿主细胞。在小鼠口咽念珠菌病模型中,感染白念珠菌野生型或ECE1再整合(ece1Δ/Δ+ECE1)菌株的小鼠与ece1Δ/Δ小鼠相比,病理切片所显示的白念珠菌的菌丝的侵袭以及组织损伤和中性粒细胞的浸润更加显著[15]。溶细胞肽毒素可诱导p-MKP1、c-Fos、细胞因子IL-1α和IL-6的产生以及上皮细胞损伤。Rebecca等[16]发现在皮肤真菌感染期间,皮肤KC中诱导了类似的效应反应,包括MAPK、MKP1、c-Fos、促炎基因和细胞因子的表达。但溶细胞肽毒素与皮肤KC的相互作用尚未具体阐明,仍需进一步的研究和探讨。

1.6 糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAGs)

糖胺聚糖是由重复二糖单元构成的大线性多糖,含有氨基糖和糖醛酸。近来研究发现糖胺聚糖可与多种细胞因子及相关酶相互作用,参与致病菌与细胞的黏附、炎症反应等[17]。Ordiales等[18]通过研究证实了GAGs参与了白念珠菌与KC黏附。罗丹明B可以抑制GAGs的合成,酵母相和菌丝相的白念珠菌与使用罗丹明B处理后的KC的黏附系数均显著降低。硫酸肝素(HS)和硫酸软骨素(CS) 作为结构不同的两种GAGs对于白念珠菌的黏附作用也不同。用肝素酶I和III处理KC后,白念珠菌对KC的黏附反而增加。用硫酸软骨素裂解酶(ABC)酶解CS的效果则相反：酵母相和菌丝相的白念珠菌对KC的黏附均显著降低。对此猜测KC表面不同种类的GAGs可能以合作的方式参与白念珠菌与细胞的黏附,另外,GAGs的降解可能有利于白念珠菌与另一类细胞表面受体结合。在随后的研究中发现,白念珠菌和表皮及真皮的细胞相互作用可调节参与HS和CS生物合成的基因的变化：在KC中CHPF出现下调,而在成纤维细胞中EXT1、EXT2、CHSY3和CHPF下调[19]。相关研究为抗白念珠菌黏附的发展开辟了新的途径。

2 KC抗白念珠菌的免疫调节

在皮肤念珠菌病中,KC是组成表皮主要的细胞,构成了抗念珠菌感染的一道重要防线。近年来多项研究表明,KC具有免疫细胞的功能。KC可表达模式识别受体(PRPs)与念珠菌表达的病原体相关分子模式(PAMPs),如白念珠菌细胞壁中的β-葡聚糖,甘露聚糖等成分,二者相互作用进而激活宿主固有免疫反应。此外,KC也可产生趋化因子诱导特异性免疫。

2.1 诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,iNOS)

NO是一种氧自由基,在人体各组织中均可生成并发挥作用,同样在皮肤的先天免疫也起重要作用,NO不仅可以杀死病原体(如细菌、真菌等),还可以调节KC的迁移并促进皮肤伤口愈合[20]。iNOS产生的NO 主要有杀死病原体的非特异性免疫作用,细菌感染可增加iNOS表达和NO生成[21]。研究表明生理状态下的KC即可表达较低水平的iNOS并产生NO[22-23],体外将白念珠菌与KC共孵育可上调iNOS mRNA和NO的生成,使用 L-NAME抑制iNOS,则KC对白念珠菌的杀伤作用大大降低,提示NO介导了KC杀死白念珠菌[24]。除此之外,NO通过cGMP/PKG-Rho GTP酶途径介导HaCaT细胞迁移[20],促进受损皮肤的修复,iNOS基因缺失的小鼠皮肤伤口的修复和愈合延迟[25]。综上,iNOS释放NO不仅可以直接杀死白念珠菌,还可以通过促进KC的迁移加快皮肤念珠菌病皮损处的愈合。

2.2 抗菌肽(anti-microbial peptides,AMPs)

宿主在抵抗病原微生物入侵的过程中可产生抗菌肽, 由KC分泌的相关抗菌肽不仅可以直接杀死入侵的白念珠菌发挥天然免疫效应,还可以介导免疫细胞产生细胞因子,趋化因子以及促炎因子发挥特异性免疫作用。其中β-防御素是在皮肤免疫中最主要的抗菌肽[26-27]。人类β-防御素(human beta-defensin,HBD)是一种富含半胱氨酸,低分子量的阳离子多肽。Rozina[28]等验证了正常人类皮肤KC可以表达HBD-2,白念珠菌感染KC后可检测到hBD-2 mRNA的表达增加,且白念珠菌菌丝相诱导hBD mRNA上调的作用强于酵母相[29-30]。先前研究表明HBD通过影响白念珠菌细胞膜的通透性及其稳态进而起到直接杀伤作用,且该杀菌作用具有盐敏感性,杀伤作用随细胞外盐浓度的升高而降低[31]。其中HBD-2和HBD-3对于白念珠菌有较强的杀伤作用,HBD-3杀伤作用更强约为HBD-2的10倍[32]。但随后Slavena等[31]通过测定荧光染料钙黄绿素的释放量,检测hBD-2和hBD-3诱导白念珠菌细胞膜损伤的能力发现HBD不会引起明显的膜破坏和膜失稳。因此推测先前报道的细胞膜损伤可能是与防御素诱导的细胞死亡相关的次要效应。近期研究证实白念珠菌细胞壁成分磷酸甘露聚糖可以通过TLR2-NF-κB,p38MAPK 信号通路产生HBD-2,HBD-3参与皮肤抗白念珠菌免疫反应[33]。除了直接杀伤作用外,HBD-2通过与细胞表面趋化因子受体6(CCR6)相互作用,趋化树突状细胞和T细胞至感染部位,发挥特异性免疫作用[34]。

2.3 模式识别受体(PRPs)

甘露糖结合受体(mannose receptor,MR) 甘露聚糖是白念珠菌细胞壁的成分之一,也是皮肤免疫系统可识别的一种重要的病原体相关分子模式。甘露糖受体是一种C 型凝集素受体( C-type lectins receptor,CLRs),具有3个胞外结构域可以识别多种内源性和外源性配体,其中8个串联的C型凝集素样结构域(CLTD)可以识别病原体的相关分子模式,如白念珠菌细胞壁的甘露聚糖、细菌的脂多糖等[35-36]。MR主要是在单核细胞、巨噬细胞、DC 表达等免疫细胞中表达,且早期研究验证了巨噬细胞甘露糖受体(MMR)对白念珠菌具有吞噬和杀伤作用,该作用可在IFN-γ的刺激下增强[37]。随后Szolnoky等[38]利用甘露糖亲和层析法从KC中分离出一种甘露糖结合受体,验证了KC表面存在甘露糖结合受体(KcMR)并可介导KC杀伤白念珠菌。KcMR对白念珠菌的杀伤作用可被甘露聚糖和甘露糖基化的牛血清白蛋白(Man-BSA)抑制。KcMR除了介导对白念珠菌直接的杀伤作用,还可以通过诱导HBD-2产生介导对白念珠菌的间接杀伤作用[39]。

Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs) TLRs作为一种重要的模式识别受体,在人体的固有免疫和特异性免疫中发挥着重要作用。目前已知的人类的TLRs家族共有11个成员,Lebre等人发现KC构成性地表达TLR1、2、3、4、5、6、9和10mRNA,而不表达TLR7和8[40-44]。TLRs通过与相应的配体结合激活信号通路MyD88(髓样分化因子受体88)-I-RAKs(IL-1受体相关激酶家族)-TRAF6(TNF受体相关因子6)- NF-κB(或AP-1),使NF-κB发生核转移介导转录产生不同的细胞因子和趋化因子。其中TLR4除了使用MyD88外,还使用一种称为β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β, TRIF)的适配器分子来启动信号转导[45]。

早期研究发现TLR2可以识别白念珠菌的磷脂甘露聚糖[46],TLR4可以识别O-连接甘露聚糖[47]。Pivarcsi等[48]证实白念珠菌可通过与TLR2或TLR4结合,激活KC的NF-κB发生核转移。NF-κB是IL-8的重要调控因子,白念珠菌通过激活NF-κB诱导IL-8表达上调,不仅可以将血液中的白细胞募集至皮肤参与免疫反应,IL-8还增加了KC对念珠菌的杀伤活性。但该作用似乎并不依赖于KC中的TLR,而是依赖于NF-κB。抗TLR的抗体与KC预孵育并不能有效降低IL-8的表达,但使用柳氮磺胺吡啶抑制NF-κB,KC对白念珠菌杀伤作用大大降低。虽然抗TLR并不能抑制白念珠菌诱导的IL-8的上调,但TLR2抗体和TLR4抗体可抑制KC的念珠菌杀伤能力,因此推测百念珠菌诱导的KC中IL-8表达上调和KC杀死白念珠菌是通过不同的途径介导的。

2.4 其他

除了上述所提及的各类抗菌肽以及模式识别受体外,KC还具有直接的杀念珠菌活性,可以通过紫外线[49-50]、IL-1[51]、IL-8和α-黑色素细胞刺激素[52]增加其活性。IL-1、前列腺素E2和血小板活化因子也已被证明参与了人表皮细胞对念珠菌的杀伤[53],但其杀伤机制尚不清楚。

3 小 结

白念珠菌作为条件致病真菌广泛存在于正常人的皮肤、口腔、胃肠道、生殖道黏膜。由于长期滥用广谱抗生素以及免疫抑制剂等,各种原因引起的皮肤黏膜屏障的损伤,或免疫功能下降而引发念珠菌病。尽管当前对于白念珠菌的致病因子及其诱导的免疫反应研究已经取得一定成果,但白念珠菌感染KC的相关靶点以及毒力因子研究仍有待进一步的发掘,KC所介导的固有免疫反应机制仍需进一步探讨。