犊牛腹泻隐孢子虫病诊断技术分析

胡书梅，薛永康，刘文思，李阳光，赵玉玺，何文章，张 震

（1.河南花花牛畜牧科技有限公司，河南新乡 453000；2.河南省奶牛生产性能测定有限公司，郑州 450002；3.河南省种业发展中心，郑州 450002）

犊牛腹泻又称犊牛拉稀，是胃肠道的消耗性疾病［1］。该病可引起犊牛生长缓慢、生产性能下降，甚至死亡，治疗费用高，治愈率低，导致牛养殖业经济效益损失严重［2］。引起腹泻的原因较复杂，隐孢子虫是主要的病原，有较高的检出率［3］。隐孢子虫病也是人畜共患病，对生物安全造成了较大的威胁［4，5］。众多学者已在隐孢子的方法建立和亚型分析方面作出了较大的贡献。

1 犊牛腹泻隐孢子虫病发生情况

1.1 病原学

隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是由隐孢子虫感染引发的水样腹泻寄生虫病，虫体寄生在动物呼吸道黏膜或胃肠道上皮细胞［6，7］，是导致奶牛和免疫缺陷病人腹泻的常见病原［8］。据报道，隐孢子虫的10 多个基因型和虫种有感染人类的风险，其中微型隐孢子虫常在人或动物肠道中被检出［6］。

隐孢子虫病流行于世界各地，由隐孢子虫感染家畜而导致的损失不可估量，尤其是犊牛感染后可引起严重腹泻、体型消瘦甚至影响后续生产性能，给畜牧业的发展带来了严重的经济损失。

1.2 流行情况

隐孢子虫不分季节发病，但是温暖潮湿环境更适合其生存［8］。全世界100 多个国家或地区（包括中南美洲、大洋洲、北美洲、欧洲、亚洲和非洲等）均有隐孢子虫病的报道［9，10］。隐孢子虫病在中国也普遍存在，且不同月龄的犊牛感染率不同，一般情况下牛隐孢子虫感染率随着年龄增长而降低，病症也会减弱，不同品种的感染率也不相同。

1.3 发病机理和临床症状

细胞骨架异常是微小隐孢子虫感染胃肠上皮细胞后的改变，导致柱状上皮细胞和绒毛膜的萎缩，肠道功能受损，引起腹泻［11，12］。部分犊牛感染隐孢子虫后不表现出症状，部分表现为严重食欲下降、腹泻、脱水等症状，但不能与其他病原导致的腹泻区分开。营养性腹泻也有明显的消瘦症状，易误诊。户外饲养的比室内饲养消耗多，易引起营养不良、身体消瘦等症状［13］。

1.4 传染源传播途径

隐孢子虫病可依靠多种路径传播，最主要的传播方式是粪口传播［14］。犊牛感染后，在5～28 d 不断外排隐孢子虫卵，造成周边环境污染，包括空气、饲料和水源［15］。健康牛通过接触携带虫卵的粪便、被污染的饲料和环境导致隐孢子虫扩散。患病牛是隐孢子虫病主要的传染源［16］。人类隐孢子虫病也可通过被污染的水源和患病动物进行传播［15］。

2 隐孢子虫病常见的诊断方法

隐孢子虫病的检测方法较多，分别从传统检测方法和新开发的检测方法入手，介绍隐孢子虫病的常见实验室诊断方法。

2.1 粪便学

漂浮法是隐孢子虫粪便学的主要测验方法。其原理主要是利用比重不同的液体，隐孢子虫卵因比重小而集中漂浮在液体表面，通过离心可收集大量的原虫虫卵。常用的方法如表1 所示。与其他2 种方法相比，蔗糖离心浮聚法检出率和回收率相对较高，但由于蔗糖溶液黏性大，导致卵囊与杂质的分离程度低，限制了卵囊的纯度［17］。常见隐孢子虫种的卵囊指数见表2。

表1 常用的富集虫卵方法及比重

光学显微镜油镜下检查，经染色的卵囊排列杂乱无章。在整个蓝绿色的视野中，清晰可见圆形或椭圆形的玫瑰红色虫卵囊，直径大小为4～6 μm；颜色深、月牙状的是子孢子。

2.2 免疫学检查

酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在规模养殖场使用较成熟，是常用的免疫学诊断技术，相比其他检测技术具有设备需求不高、批量检测、准确性好等特点［18］。因此，国内外研究者广泛应用ELISA检测犊牛腹泻隐孢子虫。

Brar 等［19］建立了ELISA 检测方法，并在印度北方地区开展相关检测，约有35%的腹泻隐孢子虫感染；Viring 等［20］对瑞典部分地区开展腹泻犊牛样本检测，发现隐孢子虫属检出率在6.1%左右。

ELISA 方法在国内外被广泛应用于动物疫病检测（包括隐孢子虫），使用最多的是美国IDEXX 的ELISA 检测试剂盒。由于成本较高，且特异性强，导致现有商品化ELISA 试剂盒大多只能检测微小隐孢子虫（高纯度抗原制备困难），在牧场、基层实验室推广缓慢。

2.3 聚合酶链式反应检测技术（PCR）

生物检测技术不断进步，常见的常规PCR、实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）、巢式PCR、数字PCR（Digital PCR，dPCR）可用于病原的检测。

2.3.1 常规PCR 该方法是最基础的PCR 方法，通过设计出特定病原保守序列的一对上下游引物，然后从样品核酸中扩增对应片段，最后通过测序确定病原种属。Gomez 等［21］设计了牛冠状病毒特异性引物，并对样本进行测试。

2.3.2 巢式PCR 巢式PCR 需要针对目标片段设计2 对引物，因此需要进行两轮反应，而且第二轮反应将使用第一轮反应的扩增产物作为模板。Silverlas等［22］建立了隐孢子虫巢式PCR 反应体系，不仅可以对样本中隐孢子虫进行检测，还可以进行基因鉴定。

2.3.3 qPCR qPCR 区别于其他PCR，主要是需要设计探针。qPCR 具有灵敏度好、特异性强、自动化程度高等优势，与其他PCR 方法相比，可以避免电泳检测，减少了核酸染料（EB）对人的伤害［23］。Cho等［24］设计出一套5 种病原（包括微小隐孢子虫）联检的多重qPCR 方法，该方法与普通PCR 方法相比，检出率在88.5%～96.8%，且特异性和敏感性都优于普通PCR。

2.3.4 dPCR dPCR 已在分子诊断过程中广泛应用，是绝对定量的检测技术。相较于qPCR，dPCR 能直观测出DNA 分子数量。但是缺少效果好的隐孢子虫dPCR 市售试剂盒产品。

与 普通PCR 和巢 式PCR 相比，qPCR 具有 准 确性高、操作简便等特点；与dPCR 相比，qPCR 具有价格低的优势。综合考虑，在不进行绝对定量的前提下，qPCR 可以在腹泻病原检测过程中作为及时有效的诊断方式。

2.4 环介导等温扩增检测技术（LAMP）

LAMP 是被很多学者应用于病原诊断的一种新型扩增技术，具有用时短、特异性高等特点，其最突出的优势是可以在恒温条件下（63±3 ℃）进行扩增。史亚东［25］基于LAMP 技术建立了快速从粪样中检测微小隐孢子虫的检测方法，通过临床验证后具有较好的特异性。LAMP 易发生非特异性扩增和气溶胶污染，是制约该技术在基层兽医实验室推广的原因［26］。

2.5 基因芯片技术

基因芯片技术在人遗传缺陷病和特定病原检测中已有使用［27，28］，该技术具有操作简便、较高的准确性、多病原同时检测和易于推广等优势，但也存在一些劣势，比如技术成本高、重复性较差、受限于仪器设备等。有部分科研院所已在动物疫病检测中应用该技术。该技术在犊牛腹泻病原诊断中的应用值得期待。

2.6 重组酶聚合酶扩增（RPA）

RPA 技术是新兴的扩增技术，可能替代常规PCR 新技术。该技术最大的优势是可在37 ℃左右的等温条件下完成扩增，且扩增过程10～20 min 就能完成，降低了核酸扩增对仪器设备的条件限制，适合用于实验室诊断和现场诊断。RPA 已在金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、衣原体等病原检测方面广泛运用，但是还未在犊牛腹泻病原检测领域应用。

3 讨论

犊牛腹泻病病原复杂，存在单独感染和多病原混合感染，症状较为相似，临床上很容易造成误诊，病牛常因为得不到及时诊断和有效的治疗，造成较大的经济损失。微小隐孢子虫既是牛腹泻重要病原，也是隐藏的人畜共患病病原，免疫力低的人员（老人和儿童等）与携带病原犊牛接触后，有一定感染风险，因此针对隐孢子虫的早期鉴别诊断对犊牛腹泻的防治较为重要。

随着检测技术的发展，越来越多的先进技术将被应用到动物疫病检测，希望隐孢子虫检测手段日趋改进，为隐孢子虫病的诊断提供支撑。