高效液相色谱-高锰酸钾氧化化学发光法测定水中的痕量苯二酚研究

2023-04-15邓依婷

化工设计通讯 2023年1期

邓依婷

（广东省中山生态环境监测站，广东中山 528400）

苯二酚是一种有机物，常用在显影剂、橡胶防老剂、食品稳定剂、石油抗凝剂中，应用领域广泛。但苯二酚也是一种具有较高毒性的会对环境和人体有极大危害的物质，其一般是以微量形式存在于植物或水体中，一旦被人体吸入或食入，会对人的中枢神经系统、肝功能等有抑制作用。因此在环境监测、食物检验等方面，有效测定苯二酚非常重要。

常规测定苯二酚的方法有气相色谱法、液相色谱法、化学发光法等，不同的测定方法均有各自的优缺点。其中，采用气相色谱法进行苯二酚测定，虽能检测出苯二酚异构体，但若是在进样温度一致的前提下，苯二酚会转变为苯醌，使得检测误差发生的概率增加；液相色谱法是以液体作为流动相的色谱法，这一测定方法无法通过色谱图直接给出未知物的定性结构，需要有已知标准进行对照参考，当在对照无纯物质时，难以进行定性鉴定，此时就需要借助红外、质谱和化学法等来配合，且对于一些稳定性较差的物质难以实现有效分析，因此需要高效液相色谱法来克服困难。但高效液相色谱法一般是紫外检测，灵敏度相对较低；而化学发光法可实现苯二酚总量的测定，其优点是灵敏度高、准确度高、仪器设备简单、操作简便快速等，对比高效液相色谱法，有更高的选择性。因此化学发光法尤其是高效液相色谱-化学发光柱后法受到了广泛关注。

我国对于酚类化合物的化学发光分析做了相应的研究，但较多是对基体成分简单的溶液中的单组分酚进行测定分析，对于高效液相色谱-化学发光柱后检测分析混合酚的研究较少。对此，构建了高效液相色谱法-化学发光柱后法用以测定苯二酚，以期实现痕量苯二酚的有效测定，同时希望能为关于酚类化合物测定分析提供一定的参考。

1 高效液相色谱法

高效液相色谱法主要是指以高压液体为流动性的液相色谱分析法，该种方式是从20世纪70年代初形成的一种新型色谱分离分析技术，本身有着选择性良好、灵敏程度极高、分析速度快、适用范围广等一系列特征，比较适合应用在高沸点、不稳定有机及生化试样的分离分析环节中。采取高压泵将有着一定极性的单一溶液或者是不同比例的混合溶液泵装到填充剂的色谱柱内，被流动相带入色谱柱内加以分离，然后进入检测器，借助记录仪或者数据处理系统记录色谱信号，分析数据获取准确的分析结果，按照固定相的不同可以将高效液相色谱法分为多方面，分别是液色谱法和液-固色谱法以及凝胶色谱法。从实际情况来看，高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上形成的现代液相色谱，和经典液相色谱没有明显的区别，不同点是现代液相色谱效率极高，能够达到自动化操作的目的，高效液相色谱的原理与经典液相色谱是相同的，不过它采用了高效色谱柱高压输液泵以及高灵敏度的检测器等，因此可以进一步提升高效液相色谱的分离效率、分析速度以及灵敏度，在借助计算机技术的基础上逐渐发展成为自动化和智能化的现代分析仪器。虽然气相色谱法是一项较好的分离和分析方式，有着分析速度快和分离效能好的特征，然而从实际情况来看，气相色谱法只可以分析处于操作温度下可以气化而不分解的物质。高效液相色谱法将经典色谱法与气相色谱法进行了融合，在技术层面使流动相成为高压输送相，色谱柱则用特殊的方法用小粒径填料进行填充，柱效要比经典液相色谱法更优，且柱后连接有灵敏度高的检测器，可实现对流出物的连续检测。

具体来看，高效液相色谱法主要具有这几个方面的特征：①高压性，流动相为高压输送，最高输送压力可达29.4MPa，可使液体快速通过色谱柱；②高速性，对比经典色谱法，高效液相色谱法的流动相在柱内的流速更快，且分析所需要的时间也较少；③高效性，这一特征主要体现在其分离效率较高，在发展过程中还会形成较多新型的固定相，进而有效提高分离效率；④高灵敏性，这是因为广泛应用了灵敏度较高的检测器，可有效提升分析的灵敏度，如常用的荧光检测器，其灵敏度可达10~12g/mL，可有效检测出有荧光的化合物；⑤应用范围广泛，对比气相色谱法和高效液相色谱法，虽然气相色谱法具有分离能力强、灵敏度高、分析速度快速等优点，但受到技术方面的现状，对于一些沸点较高的物质或者稳定性较差的物质，难以实现有效的分析。而高效液相色谱法灵敏度高，且在实际应用过程中只需要将试样制作成为溶液，不需要气化，因此不受试样的挥发性限制，这样对于沸点较高、稳定性较差、不经常挥发的有机物，便可应用高效液相色谱法进行分离分析。高效液相色谱法应用极为广泛，在高分子化合物、生物活性物质以及经常分解、沸点高、不经常挥发的物质中应用非常普遍，并且该项方式也依靠自身优势被引进了生物医学、石油化工以及食品等多项领域内。在液相色谱仪中，包含了多种类型的装置，分别表现为紫外检测装置和光电二极管阵列检测装置，两者是经常使用的检测系统。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱化学发光检测系期间使用的实验仪器主要有：输液泵、通阀进样器、化学发光检测器、蠕动泵等；使用的实验试剂主要有：固相萃取小柱3mL、乙腈色谱纯、邻苯二酚、间苯二酚和对苯二酚、分析纯、B-环糊精、高锰酸钾、甲酸、硫酸、磷酸等；实验用水为超纯水，通过纯水系统制备而成。

苯二酚标准溶液制备：称取0.01g的苯二酚用水定容于100mL容量瓶中；称取3.95g高锰酸钾用水定容于250mL容量瓶中；用1.0mol/L硫酸将溶液稀释获得100mg/L的苯二酚标准溶液；所制得的标准溶液存储在4℃冰箱中。

2.2 色谱条件

色谱柱150mm×4.6mm，5μm、流动相：甲醇0.1mmol/L、环糊精水溶液、体积比为30：70、流速0.6mL/min、进样体积50μL。

2.3 样品前处理

取200mL水样，用0.45目的滤膜对水样进行过滤，将水样中存在的颗粒物去除，随后用硫酸将其pH调整至1.5~2.0。依次用10mL甲醇对固相萃取小柱进行水活化，之后通过真空抽吸上样。待水样完全通过固相萃取小柱后，还需继续抽吸，目的是去除柱内的残余水分。最后用2.0mL甲醇对柱上的苯二酚洗脱吸附，收集洗脱液以备后续测定使用。

2.4 操作过程

将高锰酸钾溶液与甲酸溶液经混合管进行充分混合，随后与色谱柱洗脱液一同进入到发光检测系统中，待基线平稳后，在流动相注入50μL苯二酚试样中进行色谱分离，待有效分离之后，与混合液在检测系统流通池中发生反应，从而形成化学发光。最后用光电倍增管对发光信号进行检测，色谱工作站形成色谱图，根据峰值进行定量分析。

3 结果与讨论

3.1 高锰酸钾浓度与化学发光强度的关系

分析高锰酸钾浓度对化学发光强度的影响可得知，高锰酸钾的浓度越大，发光强度越强，但在高锰酸钾浓度为0.6mol/L时，发光强度达到最大值，若增加高锰酸钾的浓度，发光强度会有所降低。分析这一现象产生的原因，主要是高锰酸钾自身形成的吸光作用。所以在具体的实验分析过程中，需合理确定高锰酸钾的浓度，宜为0.60mmol/L。

3.2 反应介质与化学发光强度的关系

基于酸性条件下，高锰酸钾氧化发光反应介质主要有盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、多聚磷酸等。经过相关实验研究得知，在硫酸介质中发光信号最为稳定。进一步分析硫酸浓度对发光强度的影响，得知在硫酸浓度为1.0mol/L时，发光信号最强。因此，在本次实验分析过程中，选取的发光反应介质为1.0mol/L硫酸。

3.3 增敏剂与化学发光强度的关系

为增强化学发光反应的信号，通常会在化学发光反应体系中加入相应比例的增敏剂，常用的增敏剂有荧光棒、核黄素、聚乙二醇、十二烷基磺酸钠、甲酸、甲醛等。相关研究表明，甲酸与甲醛的增敏效果非常明显。这主要是因为甲酸与甲醛的氧化中间活性对高锰酸钾氧化苯二酚发光反应具有协同作用。同时，对比这两种增敏剂，甲酸的信噪比比甲醛更低。进一步分析甲酸浓度对化学发光强度的影响得知，甲酸水溶液体积分数为16%时，对发光强度的增敏效果最佳。因此，在本次实验中，选取体积分数为16%的甲酸水溶液作为发光反应的增敏剂。

3.4 流速及管路设计与发光强度的关系

化学发光强度也会受载液流速及管路设计的影响。有相关研究表明，在高锰酸钾与甲酸混合液流速为0.5~2.0mL/min时，不仅会减小发光信号，且会加剧柱后洗脱液在流通池中的扩散，使得色谱峰有所拓展，而如果载液流速较小，还会对信号的稳定性产生影响，从而增加信噪比。对此，通过在载液流路中设置一段混合管进行优化，让载液在进入流通池之前使其充分反应形成阻力足量的活性中间体。进一步分析得知，在混合管长度为150mm时，高锰酸钾与甲酸载液最佳流速为1.0mL/min。

3.5 色谱分离条件与化学发光强度的关系

在本次实验分析中，也重点考察了色谱分离条件对化学发光强度的影响，主要是对甲醇和乙腈作为流动相的有机相时，分别对苯二酚异构体分离效果及发光强度造成的影响。经过实验得知，甲醇和乙腈可实现3种苯二酚异构体的有效分离，但乙腈对化学发光反应有明显的淬灭作用，因此在实验中不适合使用。因此将甲醇作为流动相的有机相，并分别加入如磷酸、β-环糊精、十二烷基磺酸钠等改性剂用以进一步分析甲酸对苯二酚异构体的分析效果。实验结果表明，磷酸和β-环糊精水溶液的分离效果最优，且对发光信号基本无影响，其中以0.1mmol/Lβ-环糊精溶液的分离效果最好。通过实验，最终获得最佳的色谱分离条件：流动相为甲醇-0.1mmol/Lβ-环糊精水溶液（30∶70，体积比），流速为0.6mL/min，柱温为25℃。

3.6 样品分析

鉴于天然水体中苯二酚含量一般是在痕量水平，所以必须对样品进行富集处理后才能检测。结合实际情况，样品富集处理方法为固相萃取法。取200mL水样，经过固相萃取小柱富集处理后，再用2mL甲醇洗脱，可保证处理后的样品满足水中痕量苯二酚测定的各项要求，且富集效果好，操作便捷。

3.7 标准曲线及检出限

在确定最佳实验条件的情况下，结合配制所得的苯二酚标准溶液进行测定分析，并绘制标准曲线图。实验结果得知，3种苯二酚在2个浓度数量级范围内与发光强度呈良好线性关系。设信噪比为3，对3种苯二酚的检出限进行确定，结果得知，对比紫外检测法，高效液相色谱-高锰酸钾氧化化学发光法的检出限要低1~2数量级。同时，对质量浓度为0.10mg/L的3种苯二酚混合溶液进行连续测定，测定结果得知，邻苯二酚的相对标准偏差为2.8%，间苯二酚的相对标准偏差为3.4%，对苯二酚的相对标准偏差为6.5%。