PARP抑制剂治疗引起的卵巢癌适应性反应及意义

崔耀元，孙朝阳

(华中科技大学同济医学院附属同济医院妇科肿瘤科，武汉 430030)

卵巢癌是女性生殖系统常见且死亡率最高的恶性肿瘤，诊断后5年生存率始终低于40%。卵巢癌的一线治疗主要依赖减瘤手术和铂类化疗，但术后复发和化疗耐药是卵巢癌治疗无法回避的困境。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制剂的出现使卵巢癌患者治疗方案的选择产生了革命性变化，特别是对于乳腺癌易感基因蛋白1和2(breast cancer susceptibility gene 1/2,BRCA1/2)突变的肿瘤，PARP抑制剂显著延长了患者的无进展生存期(progression-free survival,PFS)[1]。

PARP家族，特别是PARP-1和PARP-2，是DNA单链断裂(single-strand break,SSB)修复途径的关键组成部分。PARP抑制剂引起单链断裂并不断积累转化为双链断裂(double strand break,DSB)，这些DNA损伤在BRCA1/2突变导致的同源重组修复缺陷(homologous recombination repair defective,HRD)肿瘤中无法修复进而导致细胞死亡，即“合成致死性(synthetic lethality)”[2]。尽管PARP抑制剂已在部分卵巢癌患者治疗中取得了成功，几乎不可避免的耐药性的出现，限制了该药治疗持续时间和患者获益程度。

适应性反应是指肿瘤细胞和肿瘤生态系统在面对发育和更新过程中发生的应激，或由于环境干扰时，迅速实施内源性应激缓解策略，直至其产生基因组或表观基因组改变从而获得抵抗性[3]。本文重点关注了PARP抑制剂治疗卵巢癌引起的适应性反应，这种反应发生迅速，且具有高度的可逆性和针对性，为阻止或逆转耐药的出现提供了新的靶向干预的机会。

1 肿瘤细胞固有适应性反应

1.1 信号通路的扰动 信号通路影响肿瘤生长、增殖、凋亡、侵袭和转移等广泛的细胞活动，信号通路具有高度可塑性，细胞能通过重新激活或绕过靶分子快速适应应激得以存活[4]。蛋白质是生物过程的基本功能单位，PARP抑制剂适应性反应主要发生在蛋白质水平，包括与功能密切相关的翻译后修饰(post-translationally modification,PTM)。反向蛋白组学(reverse-phase protein arrays,RPPA)是一种基于抗体抗原结合的高通量、半定量、收益高的功能蛋白组学研究方法[5]。

本课题组前期利用RPPA平台，对多种PARP抑制剂(olaparib,niraparib,BMN673)处理多种肿瘤细胞(卵巢癌、内膜癌、乳腺癌细胞)，在2D单层细胞培养、3D细胞培养、类器官(patient-derived organoid,PDO)培养条件下处理不同时间点(3d，7d)后进行了高通量的RPPA组学检测的研究，首次全面探索了肿瘤在应对PARP抑制剂压力下产生的适应性反应。本课题组及Labrie等研究发现PARP抑制剂显著激活了PI3K/AKT/mTOR通路，包括pGSK3β、pmTOR、p70S6K及其下游靶点pS6_pS235_S236、pS6_pS240_S244[6-7]。通过阻断激活通路来减少适应性反应造成的肿瘤细胞存活是研究PARP抑制剂适应性反应的目的之一， Konstantinopoulos等证明了PI3K抑制剂(alpelisib)和PARP抑制剂(olaparib)的协同作用支持了靶向适应性激活通路是有效的这一概念[8]。

此外，PARP抑制剂诱导叉形头转录因子O亚型3a(forkhead box O 3a,FOXO3a)、p27和Bim意外减少，而pBRAF、pMEK、pMAPK、pPKC和pYB1适度增加，表明存在Ras/Raf/MAPK通路激活[6]。基于此发现，本课题组在一组卵巢癌细胞系中评估了PARP抑制剂与MEK抑制剂联合应用的抗肿瘤效果，联合疗法在多种卵巢癌细胞系和体内模型中显示出协同作用，特别是在KRAS突变肿瘤中[9]。在临床前证据的支持下，本课题组启动了一项名为SOLAR的临床试验(NCT03162627)，测试MEK抑制剂(selumetinib)和PARP抑制剂(olaparib)在子宫内膜、卵巢和其他具有Ras通路改变的实体瘤以及难以治疗PARP抑制剂耐药卵巢癌中的联合应用。

1.2 细胞凋亡 细胞凋亡是在生理和病理条件下发生的有序和协调的细胞死亡过程，是主动的程序性死亡，对机体自稳调节有着重要意义 。B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)蛋白家族分为促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bad、Bcl-Xs、Bid、Bik和Bim)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bfl-1和Mcl-1) ，深度参与线粒体促凋亡分子(如细胞色素C)释放等凋亡途径[10]。本课题组发现，PARP抑制剂诱导凋亡功能介质的失衡，促凋亡蛋白Bax和Bid上调，Bim显著降低，抑凋亡蛋白BCL-XL上调[6]。Lui等[11]证明PARP抑制剂(rucaparib)与Bcl2抑制剂(CPI-203和CPI-0610)在诱导肿瘤细胞凋亡方面有良好的协同作用。

1.3 代谢应激 肿瘤代谢重编程已成为对药物诱导应激的适应性反应的关键组成部分，这可能揭示癌细胞的新的治疗可能性[12]。PARP家族以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为供体，催化单ADP核糖单元(mono ADP-ribose,MAR)或多ADP核糖体单元(poly ADP-ribose,PAR)以靶向蛋白质；该过程也分别称为MAR酰化或PAR酰化[13]。Bajrami等[14]在三阴性乳腺癌中观察到烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,NAMPT)抑制剂减弱了PARP抑制所诱导的肿瘤NAD+水平的增加，并且联合疗法进一步抑制了肿瘤的增殖，表明PARP抑制剂与NAD+消耗性药物的联合具有潜在的治疗益处。

Tang等[15]发现，PARP抑制剂可增加腺苷5-单磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5-monophoshate-activated protein kinase,AMPK)磷酸化激活，AMPK是由低ATP和高AMP水平(即高AMP/ATP比率)激活的细胞能量传感器，可通过磷酸化下游底物3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase,ACC)使其失活从而抑制胆固醇和脂肪酸合成[16]。

1.4 内质网应激 作为真核细胞的重要细胞器之一，内质网(endoplasmic reticulum,ER)主要发挥运输和整合蛋白质、协助蛋白质折叠和运输、脂质生物合成和维持钙稳态等功能。一旦缺氧、代谢应激或错误折叠蛋白质等破坏机体稳态，真核细胞将通过一系列内质网应激(ER stress)适应性途径对内质网功能障碍做出快速反应[17]。Bahar等[18]发现PARP抑制剂激活内质网应激，增强葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein,GRP78)、钙结合伴侣凝集素(calnexin)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)蛋白表达。

2 肿瘤免疫微环境的适应性反应

肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment,TIME)主要成分包括免疫细胞(如T细胞、树突状细胞)、肿瘤相关成纤维细胞、细胞外基质和血管，调控肿瘤发展、浸润及转移[19]。肿瘤的发展伴随着癌细胞和TIME之间多种复杂的相互作用，肿瘤细胞和间质环境及其相互作用均受靶向治疗影响，并对肿瘤进展有重要影响。

2.1 免疫细胞的适应性反应 多项研究表明，PARP家族在免疫细胞中发挥一定作用。PARP1/2调节几种常见的炎症因子和细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和白细胞介素1-β(interleukin 1-β,IL1-β)[20]。Shen等发现PARP抑制剂诱导胞质双链DNA(double stranded DNA,dsDNA)积累，进一步激活环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)/ 膜蛋白干扰素刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)/ TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)/ 干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)先天免疫途径，诱导I型干扰素(interferon,IFN)及其相关免疫反应，无论实验模型是否有BRCA1/2突变[21]。然而，Jiao等发现PARP抑制剂通过糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)失活来上调程序性死亡受体-配体1(PD ligand 1,PD-L1)的表达，使癌细胞对T细胞介导的靶细胞杀伤更有抵抗力进而造成免疫微环境的免疫抑制[22]。基于PARP抑制剂上调PD-L1表达，Lampert等证明PARP抑制剂(olaparib)与PD-L1抑制剂(durvalumab)联合疗法在Ⅱ期临床试验中有一定的临床疗效[23]。总之，PARP抑制剂对免疫微环境的影响复杂而微妙，需在多种模型和临床试验中进一步探索。

2.2 肿瘤相关成纤维细胞的适应性反应 肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)是基质的主要组成部分，分泌生长因子、炎症配体和细胞外基质蛋白，促进肿瘤的增殖、抗治疗和免疫排斥[24]。Martincuks等[25]在PARP抑制剂治疗后的卵巢癌患者的肿瘤活检中，发现CAF中转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)激活增加。高水平的STAT3与晚期卵巢癌和不良预后相关，STAT3在卵巢癌患者CAF中的上调可能通过促进治疗抗性和免疫抑制来促进疾病的进展。Kettner等[26]证明了PARP抑制剂(olaparib)和STAT3抑制剂(napabucasin/TTI-101)联合显著增加了帕博西尼(palbociclib)耐药的乳腺癌细胞的死亡。此外，Linares等[27]发现PARP抑制剂通过抑制转录因子激活蛋白1(transcription factor activator protein-1,AP-1)、c-FOS和c-JUN的PAR化，引起p62下调，导致CAF激活从而成为肿瘤进展的催化剂，这表明抑制CAF活性的药物与PARP抑制剂的联合疗法可能带来临床受益。

2.3 血管生成的适应性反应 血管生成是新血管形成的过程，在正常的卵巢生理学以及卵巢癌的侵袭转移中起着关键的作用，是一个由血管生成激活因子(如VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β)和抑制因子(如Angs、TSP-1)共同调节的复杂过程[28]。PARP-1的过表达通过直接或间接调节VEGF-A的表达和分泌，进而在上皮性卵巢癌、结肠癌、肝细胞癌中发挥了促血管生成作用[29]。Bizzaro等[30]在一组卵巢癌PDX模型中证明了在临床相关剂量下使用PARP抑制剂(olaparib)和VEGFR抑制剂(cediranib)治疗表现出良好的抗肿瘤活性，且不依赖于HR状态 。

3 展望

卵巢癌靶向治疗的耐药性是一个重要挑战，为了延长靶向药的反应时间和改善患者预后，了解肿瘤和肿瘤免疫微环境在治疗压力下的变化是极其必要的。适应性反应发生发展的机制复杂，机体在内外应激源诱导下，产生多种信号转导通路变化、代谢应激、内质网应激，以及通过肿瘤和肿瘤免疫微环境的复杂相互作用，最大限度发挥自身抵抗能力获得耐药性。卵巢癌患者在接受PARP抑制剂治疗1～2周即可检测到PARP抑制剂引起的适应性反应，且不同患者治疗后样本保持了部分相似的适应性反应[7]。基于对适应性反应的客观分析，靶向适应性反应开发合理联合用药方案是对抗PARP抑制剂耐药的一大利器，不仅可进一步抑制肿瘤发展，同时可能延缓耐药性克隆的出现，为改善临床患者预后提供机会。目前多种PARP抑制剂联合其他小分子抑制剂的疗法通常具有一定的协同效果，但常因为受到毒性限制而无法真正应用于临床。我们应采取灵敏而精准的工具，如RPPA，判断某治疗阶段治疗压力引起的特征性变化，通过联合疗法、序贯疗法等符合肿瘤适应性反应的方式来实现个体化精准而安全治疗的目的。

4 总结

综上所述，卵巢癌诊断时间晚、复发率高，是病死率最高的妇科恶性肿瘤。PARP抑制剂使BRCA1/2突变卵巢癌患者的预后大为改善，但仍面对靶向药物耐药的通病。PARP抑制剂治疗卵巢癌后会引起肿瘤和肿瘤免疫微环境的适应性反应，如何利用适应性反应针对性开展联合疗法，可能是延缓或逆转PARP抑制剂耐药的有效手段。