趋化因子用于结核病诊断的研究进展

马子淳 尚媛媛 逄宇 李姗姗

结核病的诊断亟需更加高效、便捷的新方法和新技术。结核病的诊断方式多样，痰涂片检出率低；作为病原学诊断金标准的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)培养耗时长；结核菌素皮肤试验特异度不高，存在一定的风险[1]。目前，环介导等温扩增、线性探针分析、GeneXpert MTB/RIF和全基因组测序等新型分子诊断方法已被用于结核病的诊断。但是具有高敏感度、用时短，以及成本低的生物标志物仍有待挖掘[2]。趋化因子是一个庞大的分泌蛋白家族，通过细胞表面G蛋白偶联受体发出信号[3]，趋化细胞迁移。研究表明，趋化因子对结核病导致的肉芽肿形成和维持，以及从外围募集淋巴细胞定位于肉芽肿中起着关键作用[4]。趋化因子及其受体在结核病诊断中的相关研究正逐渐成为热点。

一、趋化因子概述

1.趋化因子的结构及其分类：趋化因子是一类高度保守的蛋白家族(相对分子质量8000～12 000)，参与许多生物过程，包括趋化细胞迁移、免疫细胞脱颗粒、造血和血管生成[5]。趋化因子通常根据其高度保守的半胱氨酸残基的顺序定位被分为3个亚家族，分别是CC模体(C-C motif，CC)趋化因子、CXC模体(C-X-C motif，CXC)趋化因子、C-X3-C模体(C-X3-C motif，CX3C)。在CC亚家族中，前2个半胱氨酸是相邻的。在CXC亚家族中，前2个半胱氨酸被1个氨基酸残基分离。而CX3C趋化因子在前2个半胱氨酸残基之间有3个氨基酸。C趋化因子亚家族是一个例外，只有1个N端半胱氨酸残基，缺少这些半胱氨酸的第1个和第3个残基。这些特殊的分子结构与其作为趋化因子的功能密切相关[3]。

2.趋化因子的生物学功能：趋化因子大多被归类为炎性因子。它们在炎性反应中控制免疫细胞募集过程中起着关键作用，即趋化因子在组织免疫反应方面发挥着重要作用[6]。趋化因子在人体内与自身相对应的靶细胞上的受体结合，通过诱导G蛋白的β、γ亚基解离的方式激活相应的信号通路，发挥其生物学功能[7]。不同类型的趋化因子其分工也各不相同，CC趋化因子主要趋化单核细胞，CXC趋化因子主要趋化中性粒细胞，C趋化因子可对淋巴细胞起趋化作用，CX3C亚家族主要参与巨噬细胞和淋巴细胞的迁移和活化[8]。除此之外，趋化因子还在人体免疫系统中发挥着其他功能。如CCL25-CCR9轴，它在胸腺T细胞发育中起着重要作用[6]。

3.趋化因子在MTB感染过程中发挥的作用：趋化因子对于招募和协调免疫细胞进入MTB感染的肺部这一过程至关重要。单核细胞募集和定位可以有效控制细菌的增长，防止其发展为弥漫性的粒细胞炎症[9]。如干扰素诱导蛋白10(IP-10/CXCL10)可以通过与靶细胞的受体结合来介导人体内免疫细胞的迁移和活化，在抗结核免疫中发挥重要的作用[10]。但同时，某些趋化因子和细胞因子则加剧感染的扩散及组织的破坏，他们对于抗MTB感染过程的作用是双重的，在特定条件下，趋化因子也会导致不呈比例的炎症和肺损伤，从而加速肺部疾病和空洞化的进展[11]。因此，通过对特定的趋化因子的定量检测，有可能对患者的病情发展进程及预后情况进行评估[12]。

二、CCL(C-C motif)及其受体

1.CCL1：CCL1是CC趋化因子家族中的趋化因子，其受体为CCR8。它由活化的T细胞分泌，吸引其他免疫细胞包括单核细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞到感染部位[13]，作为T细胞激活标记物的CCL1的大量表达反映了控制MTB的持续免疫反应。研究表明，趋化因子CCL1在肺结核患者的血浆中的浓度明显增高[4]。同时，CCL1和抗炎细胞因子白细胞介素-2Ra(interleukin-2Ra，IL-2Ra；CD20)在结核病患者中的表达浓度高于潜伏感染个体，并且在组间鉴别诊断方面具有很强的潜力。在区分未感染HIV个体是活动性结核病还是结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)状态时，CCL1被列入前20个最精准的诊断标志物组合，由RANTES、CCL1、CRP和MIP-1α组成的四联生物诊断指标可在无论是否感染HIV的前提下区分活动性结核病和LTBI[14]。

2.CCL2(MCP-1)：CCL2是一种强大的炎性趋化因子，属于C-C家族，其受体为CCR2。CCL2可协助单核细胞和活化T细胞趋化募集到MTB感染的部位，使其发挥抑菌功能，并可促进肉芽肿的形成，与结核病的发展有着密切的联系[15]。有报道称，CCL2对MTB具有保护作用，在激活巨噬细胞的同时被肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激[16]。CCL2与Th1细胞因子如γ-干扰素和TNF-α呈正相关，因此，对于Th1细胞对结核病的适当应答至关重要，其表达量的高低会影响结核病的易感性[17]。相关研究表明，CCL2的表达量与肺结核患者预后效果差的风险性相关，其有望成为评估肺结核患者预后情况的免疫学指标[18]。

3.CCL3(MIP-1α)和CCL4(MIP-1β)：CCL3和CCL4有68%的氨基酸是同源的。人CCL3和CCL4在大多数成熟造血细胞中诱导表达，CCL4已被确定为结核病易感基因[19]。CCL4的唯一受体是CCR5。CCL4是NK细胞、单核细胞和其他免疫细胞对感染部位的趋化剂。它诱导其他细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α从成纤维细胞和巨噬细胞的合成和释放。CCL4先前已被证明可以在唾液和血清中区分结核病和其他肺部疾病[20]。但也有研究表明，CCL4在使用横向流动分析法测定其在胸腔积液和全血中的水平以诊断结核病的实验中特异度不高，有待进一步研究[21]。通过新一代QuantiFERON(QFT)检测方法，研究人员发现CCL4在活动性结核病患者中的表达要远高于LTBI者[22]。一项研究通过对结核病患者血浆中的趋化因子进行单变量和多变量条件回归分析，发现基线血浆CCL3和CCL4的浓度与不良治疗结果的增加率相关：并且发现血浆CCL4在诊断肺结核时的敏感度和特异度较低，但相反，CCL3具有85%的敏感度和85%的特异度，表明CCL3更有希望作为预测结核病预后情况的生物学指标[18]。

4.CCL5(Rantes)：CCL5是趋化因子家族中十分重要的一员。它主要参与免疫调节和炎症反应，发挥招募、激活和共同刺激T细胞和单核细胞的作用，可抑制MTB的生长[23]。CCL5的主要受体为CCR5，其通过与CCR5的相互作用，可以募集CD4+T细胞等相关免疫细胞进入受MTB侵害的部位，在结核免疫应答中发挥十分重要的作用[10]。此外，研究表明，编码CCL5的rs2107538基因和rs2280788基因的多态性与结核病易感性相关[24]，因此，有可能通过测定特定CCL5的基因对人群进行早期筛查，以早期诊断和预防。此外，CCL5也可用于结核性胸腔积液的诊断。研究表明，结核性胸腔积液患者血浆CCL5水平明显高于恶性胸腔积液患者[25]。综上，CCL5在MTB感染免疫过程中发挥重要作用，且在基因表达上与MTB感染存在相关性，有望在未来成为结核病诊断的生物标志物。

三、CXCL(C-X-C motif，CXC)及其受体

1.CXCL1和CXCL2：CXCL1是一种由巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞表达的C-X-C基序趋化因子，通过趋化因子受体CXCR2发挥作用。CXCL1 在创面愈合过程中由生血管部位的角质细胞和内皮细胞表达。CXCL2同样属于趋化因子家族的一员，其与CXCL1的同源性达90%。CXCL1介导心脏等多种器官的急性和慢性反应，其表达与其纤维化密切有关[26]。最新研究通过动物种群模型实验的方法发现CXCL1诊断区分活动性肺结核患者和LTBI者的效果显著，其敏感度为94.5%，特异度为88.8%；区分结核病和非结核病患者的敏感度为90.9%，特异度为71.4%，其未来有希望成为快速诊断结核病的生物学靶点[27]。Kumar等[4]同样发现CXCL1和CXCL2在肺结核患者的血浆中高度表达。其中，CXCL1的表达水平可以反映疾病的严重程度和范围，CXCL1不但可以作为结核病病理诊断的候补标志物，还可以作为细菌负荷量及培养转化情况的生物标志物。综上，CXCL1和CXCL2有望作为疾病严重程度、细菌负担和治疗监测的中等良好的生物标志物。

2.CXCL8(IL-8)：CXCL8是趋化因子家族中十分重要的一员，在人体内主要发挥两个功能，即：化学吸引和激活多种类型的免疫细胞。CXCL8在结核病的免疫应答中同样发挥十分重要的作用。其已被证实参与结核肉芽肿的形成并充当宿主抵御MTB感染的关键调控因子[28]；其通过将中性粒细胞募集到感染部位的方式使宿主具备抗结核的能力[29]。研究表明，在结核病患者的血浆中CXCL8的表达明显上调，血浆含量从对照组的18.6 pg/ml提高到294.4 pg/ml[18]。并且，对CCL3、CXCL8和CXCL10进行混合受试者工作特征曲线分析发现，3种趋化因子组合后的曲线下面积(AUC)为0.937～0.969，敏感度为82%～96%，特异度为87%～92%，具有良好的诊断效能。因此，Kumar等[18]认为CXCL8是肺结核治疗效果的高度预测性生物标志物。Yao等[30]也通过实验证实了CXCL8在活动性结核病患者和LTBI者中存在差异性表达。综上，CXCL8在对结核病的诊断及预后评估方面是一个十分有潜力的生物学标志物。

3.CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC)及其受体CXCR3：CXCL9、CXCL10和CXCL11都通过CXCR3发挥免疫应答作用。从分子结构角度来说，CXCL9、CXCL10和CXCL11都缺乏谷氨酸-亮氨酸-精氨酸，彼此之间具有明显的结构同源性[31]。它们都和Th1细胞免疫功能息息相关，具有招募单核巨噬细胞、T细胞、NK细胞和嗜碱性粒细胞的功能。在结核病的免疫应答过程中，这三者与CXCR3受体一起发挥着不可替代的作用。Shang等[32]最新研究发现，CXCL9和CXCL10及它们的受体CXCR3在结核病变组织及外周血中高表达，揭示了其作为诊断标志物的可能性。CXCL10 作为如今结核病免疫诊断的核心标志物，与其相关的研究进展颇多。Kumar等[4]研究发现，抗结核化疗结束时肺结核患者的趋化因子血浆CXCL10 水平明显升高。此外，活动性结核病患者CXCL10水平较对照组明显增高，且与病情严重程度呈正相关。有研究发现，血清CXCL10在诊断活动性肺结核时的AUC值达0.848，且具有较平衡的敏感度(80%)和特异度(80%)，表明CXCL10可能用于预测MTB感染的活动性[21]。Korma等[33]通过RT-qPCR分析提出CXCL10可以将肺结核患者与LTBI者有效区分，其AUC为0.731；同时，将CXCL9和CXCL10联合用于区分肺结核与肺外结核，其敏感度高达85.7%，特异度达73.9%，揭示了细胞因子和趋化因子的表达水平可能是区分MTB感染状态的有效标志。Qiu等[34]通过汇总18项CXCL10的相关研究，纳入2838例结核病患者，对CXCL10的诊断效能进行了全面评估，发现CXCL10检测肺结核的敏感度为86%，特异度为88%，可有效区分结核病和非结核病患者，是一个有应用价值的诊断标志物。结核性淋巴结炎的诊断具有挑战性。研究表明，CXCL9和CXCL11作为CXCR3的配体，用于诊断结核性淋巴结炎的能力要优于γ-干扰素释放试验，可作为结核病有效的诊断标志物[35]。魏兰等[36]通过实验同样证实了CXCR3及其配体有助于活动性肺结核诊断，且CXCL11和CXCL9的评价作用更为突出。综上，CXCR3及其配体可能是诊断结核病和临床评估结核病患者严重程度的有效生物标志物[37]。

4.CXCL13(BCA-1)：CXCL13是C-X-C基序稳态趋化因子中的一员，也被称为B细胞趋化因子和B细胞趋化因子-1(BCA-1)，其对B-1和B-2亚群的B细胞具有选择性趋化作用，通过与趋化因子受体CXCR5结合发挥其生物学作用。CXCL13可促进非淋巴器官异位淋巴样结构的新发生，已被证实在慢性炎症疾病中发挥重要功能。研究表明，CXCL13可作为特发性肺纤维化的强大的预后进展标志物[38]。但其在肺结核的诊断及预后的预测方面的研究仍有待开展。研究表明，在感染MTB的小鼠模型中，CXCR5及其配体CXCL13的表达增高，进而发挥抗MTB感染免疫作用[39]。另一研究则发现在结核性胸膜炎患者的胸腔积液的程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)阳性(PD-1+)和PD-1-黏膜相关恒定T细胞(MAIT细胞)中，CXCL13是差异表达最显著的基因[40]。最新研究表明，检测血清中IP-10 和BCA-1可实现对活动性结核病和LTBI的鉴别(AUC=0.83)[41]。因此，虽目前对CXCL13作为结核病诊断标志物的研究仍不够深入，但其存在一定的研究价值。

四、CX3CL(C-X3-C motif)及其受体

CX3CL1(fractalkine)是一个由CX3C结构域和黏蛋白柄组成的结构独特的趋化因子，是CX3C家族的唯一成员。CX3CL1与CXCR1结合发挥趋化因子作用，并具有黏附分子功能[42]，其在炎症条件下激活靶细胞引起下游免疫应答[43]。较早的研究发现，活动性肺结核患者唾液中CX3CL1浓度较高，其表达的差异性有可能利于结核病的检出[20]。Estévez等[41]也通过实验证实CX3CL1是区分活动性肺结核患者和LTBI者的最佳单一标志物，且其与IL-12p40联合诊断具有区分LTBI者与非LTBI者的良好性能。

五、总结与展望

1.亟待筛选结核抗原特异性的趋化因子组合：趋化因子及其受体在结核病的发生发展及转归中扮演十分重要的角色，其中，多种趋化因子具有作为结核病诊断的生物学标志物的潜力。但是，先前诸多针对结核病诊断的研究多基于前人成果进行相关经验的总结和理论的推测，选定单个或多个可能在宿主对抗MTB感染中发挥作用的趋化因子进行分析，而非通过对大量趋化因子筛查的基础上获得的具有鉴别诊断价值的趋化因子及其组合，未来研究可通过液相芯片及流式分析等新颖的研究方式，对结核病患者所表达的趋化因子及其受体进行高通量筛查，再对通过筛选后明确特异性表达的标志物进行实验验证，从而提高筛选组合对于结核病的特异性。此外，既往研究大多关注外周血静息态的趋化因子状态。然而，这种状态容易受到患者共患疾病、免疫状态及服用药物的影响，筛选结核抗原特异性的趋化因子能够有效排除上述干扰，提高检测效能，同时，抗原刺激的过程亦是检测信号放大的过程，有助于提升检测的准确性。

2.与病原学诊断方法的组合诊断模式：前述研究发现趋化因子在抗结核中的重要作用，然而，对于患者外周血趋化因子的影响因素缺乏系统研究，其浓度与患者的免疫状态、基础性疾病和载菌量等因素的关联尚不明晰。未来探索上述关系对于提高其诊断敏感度具有重要价值；特别是作为一种潜在的免疫学诊断方法，如何作为病原学诊断技术的重要补充，提高菌阴结核病患者的诊断效能，针对不同人群设定适宜的诊断界值以提高特殊人群的诊断效能至关重要。在筛选获得特异性的趋化因子组合基础上，开展与病原学诊断技术的联合评估有望成为一种新型的结核病诊断策略。

综上所述，目前临床诊断结核病仍存在诸多困难，基层医院缺乏对结核病和耐药结核病进行早期、快速、简便和准确的诊断方法，不利于对结核病患者的及早发现和治疗及预防疾病在社区传播。趋化因子作为新兴的分子靶点，具有检测便捷和耗时短的优势，近些年已成为结核病诊断研究方向的热点；提高特异性的趋化因子筛选及相关影响因素的解析，将帮助我们全面开发适宜菌阴结核病患者诊断技术的新方法，同时，也为探索趋化因子在宿主抗结核免疫应答机制领域研究开拓新思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献马子淳和李姗姗：起草文章；尚媛媛：对文章的知识性内容作批评性审阅；逄宇：对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政/技术/材料支持