巴尔喀什蘑菇子实体漆酶纯化与理化特性及对酚类化合物的降解能力

努尔孜亚·亚力买买提,郝敬喆,贾文捷,陈浩宇,罗 影,贾培松

(新疆农业科学院植物保护研究所/农业农村部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆特有大型野生食用菌巴尔喀什蘑菇,其成熟子实体埋藏在地面下30～50 cm土层内[1]。焉耆县博斯腾湖区的芦苇滩由于特定的生态环境,适宜该菇的生存,该菇子实体生长在红柳和芦苇根部腐质层中,5月和10月为子实体形成期,成熟的子实体个体形态差异较大。目前该野生菇未能实现人工栽培繁育。真菌漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶,能降解木质素,去除许多酚类物质的毒性,研究巴尔喀什蘑菇子实体的生物学特性、漆酶理化性质及对酚类化合物的降解能力具有重要意义。【前人研究进展】食用菌分类上通常采用形态学与ITS区序列测定等方法鉴定种属关系[2]。巴尔喀什蘑菇以芦苇、红柳等植物纤维素和木质素为菌体生长发育提供小分子营养物质和能源[3],而木质素降解依赖真菌漆酶反应活性高低,酶的催化活性强弱在一定程度上决定真菌菌丝对培养料的生物转化率[4]。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,广泛存在于自然界的多种植物和菌类的分泌物中,催化酚类或芳胺类等多种底物[5]。漆酶反应活性常受温度、pH值和金属离子浓度变化产生促进或抑制作用[6]。【本研究切入点】巴尔喀什蘑菇栽培驯化过程中,漆酶活性高低是提高产量的重要环节,需研究巴尔喀什蘑菇漆酶的蛋白质结构和自身的理化特性,挖掘该漆酶对木质素等物质分解效率。【拟解决的关键问题】以采集的博湖县黑蘑菇通过ITS区PCR扩增比对,结合子实体形态鉴定为巴尔喀什蘑菇。抽提该蘑菇子实体漆酶为研究对象,对其进行分离纯化,得到漆酶分子大小、N端结构,并对其催化底物、要求的温度、pH值、金属离子促进抑制率等理化性质进行研究,得到该酶活性范围和最大利用率。

1 材料与方法

1.1 材 料

采自新疆博湖县博斯腾湖周边野生蘑菇巴尔喀什菇子实体。

1.2 方 法

1.2.1 菌丝体培养

将采集的野生蘑菇子实体表面消毒,取髓部组织置于新鲜PDA试管斜面培养基中央,置于25℃培养箱中培养3 d;从纯化好的PDA斜面培养基上,再次用灭菌的接种针钩取前端菌丝移入新鲜PDA斜面培养基中间,置于25℃培养箱中培养,待菌丝长满斜面后放在4℃冰箱保存。

1.2.2 菌种鉴定

(1)形态学鉴定参照菌物学分类文献的方法[7];(2)ITS鉴定:依据DNA提取试剂盒的方法提取真菌子实体基因组DNA。通用引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4:TCCTCCGCTTATTGGATATGC。PCR 扩增条件:94℃,预变性5 min;94℃,变性30 s,50℃,退火45 s,72℃延伸,100 s,循环30 次;72℃延伸5 min。PCR 产物经0.8%的琼脂糖凝胶140 V,电泳1 h,按胶回收试剂盒说明书回收PCR 产物。将胶回收产物送上海生工生物技术公司测序,将获得的碱基序列提交GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库,采用在线软件BLAST 进行碱基序列比对分析,利用MEGA 5.0 系统进化树的构建。

1.2.3 子实体漆酶抽提

取50 g新鲜子实体500 mL 10%NaCl去离子水溶液4℃匀浆液过夜,浸提12 h,8 000 r/min离心10 min,取上清液即为粗酶液,4℃冰箱保存。测酶活力。

1.2.4 漆酶活性的测定

将10 μL漆酶样品和190 μL底物ABTS溶液混合均匀,置于30℃水浴5 min反应,迅速加入300μL 3.8%HClO4终止反应,8 000 r/min离心5 min后取上清于420 nm测定吸光度,对照组用10 μL去离子水代替漆酶样品。每个测定条件设3个平行,数据结果取平均值。酶活定义:在30℃下,以每分钟氧化1 μmol 的ABTS 所需要的酶量定义为1 个酶活力单位,酶活性以U/mL 表示。参照文献的方法[8],计算公式如下:

1.2.5 漆酶的纯化

依照1.2.3方法提取上清液。上清液首先经2.5 cm × 20 cm的CM-cellulose阳离子交换柱分离纯化,该柱预先使用10 mmol/L NaAc-HAc缓冲液 (pH 4.5) 平衡,用同样的NaAc-HAc缓冲液和分别含0.2、0.5及1.0 mmol/L NaCl的NaAc-HAc的缓冲液洗脱,收集漆酶活性组分,再使用10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.2) 平衡过的阴离子交换柱Q-Sepharose (1 cm × 10 cm) 进一步分离, 分别使用缓冲液和0～1 mmol/L NaCl梯度洗脱后, 得到活性组分, 透析后用Superdex 75 HR 10/30凝胶过滤层析柱经快速蛋白液相系统AKTA Purifier (GE Healthcare) 进行分子筛分离 (0.2 mmol/L NH4HCO3, pH 8.5),冻干活性组分。送上海生工生物技术公司进行蛋白质质谱鉴定。

1.2.6 漆酶酶学性质

最适反应温度:漆酶酶促反应的时间均定为10 min。根据酶活测定方法,分别测定4、10、20、30、40、50、60、70、80和90℃,10 个不同温度下,酶促反应10 min 后的酶活,以等体积的蒸馏水代替酶液为空白对照,将各温度下测得漆酶的酶活,以最高酶活力计为100%, 计算相对酶活力;

最佳pH :配制不同pH 值(4～10)的缓冲液,在30℃温度下测定不同pH 值对酶活力的影响,以等体积的蒸馏水代替酶液为空白对照,反应10 min 后用300 μL 5%TCA终止反应,测定酶活;

金属离子对酶活的影响:配制终浓度为5、2.5和1.25 mmol/L 的不同金同的金属离子(K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+),取10 μL 金属离子溶液加入到190 μL ABTS缓冲溶液中测定其漆酶活力,以添加等量去离子水为对照组。定义对照组酶活为100%,计算各金属离子影响下漆酶的相对酶活,用相对酶活表示金属离子对酶活的影响。

底物多样性对漆酶的催化特性影响:配制咖啡酸、没食子酸、甲苯胺、联苯胺、邻苯二酚、2,6二甲氧基酚、愈创木酚、对苯二酚和ABTS等终浓度为5 mmol/L的不同底物浓度溶液,取10 μL漆酶样品加入到190 μL底物缓冲溶液中混合均匀,25℃水浴反应10 min,用300 μL 5% TCA终止反应,分别测定各底物在最大吸收波长下的吸光值,每组做3个重复。以添加等量去离子水为对照组。定义活性最高组酶活为100%,计算各反应底物影响下漆酶的相对酶活。

1.3 数据处理

利用SPSS Statistic 20.0(www.ibm.com/software/analytics/spss)对所得数据进行单因素方差检验(One - way ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 野生蘑菇(巴尔喀什)子实体形态学鉴定

研究表明,子实体个体较大,多为单生或散生。菌盖半球形,直径8～20(40)cm,后平展,中央平或稍凹陷,具有纤维质尖端翘起的鳞片,淡褐黄色;菌肉结实质密,厚度3～6 cm,刨开创面初为淡红色,逐渐变为红色-紫红色-褐色-黑色,离生或弯生;菌褶密,不等长;菌柄长7～25(47) cm,粗3～6(9) cm,中生,近圆柱形,基部膨大弯曲;菌环双层,上层在菌柄上部,宽大,淡褐色,下层菌环窄小。孢子印黑褐色,担子棍棒形,着生担孢子2～4个。图1

注:a.巴尔喀什菇湖畔生境;b.地下30 cm处子实体;c.子实体形状;d.孢子印;e.单孢子和孢子梗(10×40X);f.菌丝形态

2.2 野生巴尔喀什菇TS基因序列及系统发育分析

研究表明,将DNA 进行胶回收,并送生物技术公司测序,得到BHBC ITS基因的PCR 扩增产物片段长度为697 bp。将ITS基因序列与GenBank 数据库中的序列进行同源性比对,BHBC与A.balchaschensis(HQ446468)的基因序列自然聚类。选出9株与BHBC ITS基因序列同源性达99%的基因序列。BHBC 与A.sinodeliciosus(KM657914.1),A.subperonatus(KX505304.1),A.desjardinii(KM657906.1)聚为一簇,相似性也最高,为99.5%,BHBC与A.balchaschensis的亲缘关系最近。图2

图 2 BHBC 基因PCR 扩增产物电泳检测(左)基于ITS基因序列相似性的菌株的系统进化树(右)

2.3 野生巴尔喀什菇子实体漆酶纯化

研究表明,得到巴尔喀什蘑菇子实体活性组分SU1。得到电泳纯的漆酶,酶的比活力由粗提物的0.048 U/mg 提高到17.02 U/mg,纯化倍数为354.58。表1

表1 野生巴尔喀什菇漆酶纯化变化Table 1 Results of laccase purification from A. balchaschensismushroom

2.4 野生巴尔喀什菇漆酶N-端氨基酸序列的分子量

研究表明,纯化的漆酶在Superdex 75分子筛过滤。计算其分子量为65 kDa,漆酶N端的氨基酸序列为SGGPEQNTTA,与以前分离的蘑菇漆酶部分氨基酸残基有明显的相似性。与Pleurotusostreatuslaccase和Phlebiaradiatalaccase包涵SXGP同源序列,与BasidiomycetePM1laccase、CeriporiopsissubvermisporalaccaseI、Lepistanudalaccase、Pycnoporuscinnabariuslaccase、Russulavirescens、TrametesversicolorlaccaseI、TrametesversicolorlaccaseII、TrametesversicolorlaccaseIII和Tricholomamongolicumlaccase等包涵XXGP同源序列。表2

2.5 野生巴尔喀什漆酶理化性质

研究表明,该菌株的最适温度为40℃,当温度为4℃时,仍有活性。在4～50℃,随着温度升高,酶活力增加,在50℃时,酶活力达到最大值,达到51.65 U/mL,当温度超过50℃,酶活开始急剧下降,BHBC子实体漆酶属于中低温酶。图3

漆酶活力随着pH 值的升高而降低,pH 2.2超后,酶活力下降,pH 4.5有小波动,子实体漆酶的最适反应pH 值为2.2,属于酸性漆酶。在pH 2～9 均有活性。图4

表2 野生巴尔喀什蘑菇漆酶蛋白质 谱与其他已报道的漆酶相似性比对Table 2 N-terminal sequence comparison ofAgaricus balchaschensis laccase and other mushroom laccases

图3 不同温度下巴尔喀什蘑菇漆酶活性变化

图4 不同pH下巴尔喀什蘑菇漆酶活性变化

除Cu2+对漆酶活性的有促进作用外,几乎所有的金属离子对漆酶活性均有抑制作用,伴随溶液中离子浓度的降低抑制力逐渐减弱,中低浓度变化相对不大。Cu2+对漆酶活性的5 mmol/L浓度时的相对酶活为105.35%,相对Hg2+离子的抑制作用最大,高浓度5 mmol/L的相对酶活为6.94%,低浓度1.25 mmol/L的抑制率是12.21%; 5 mmol/L时的相对酶活是91.35 %;Mg2+、Mn2+、Pb2+和Cu2+离子在低浓度时的抑制作用比中浓度略有增加。表3

蘑菇漆酶对不同底物的降解活性有较大的差异。对ABTS的降解活性最高,甲苯胺和对苯二酚活性较高分别是15.77%和34%,对咖啡酸、没食子酸、邻苯二酚、2,6二甲氧基酚和愈创木酚活力较低。表4

表3 不同金属离子下漆酶活性变化Table 3 Effect of metal ions rate of laccase from A. balchaschensis (%)

3 讨 论

采自焉耆县野生蘑菇巴尔喀什菇子实体的菌环呈两层、双环结构,明显区别于双胞菇和大肥菇,菌盖初期卵球形,后变平展,污白色,表面光滑或有鳞片;菌髓白色受伤遇空气变红色;菌褶初期白色后变成红褐色,菌肉厚与黑伞属菌的特征高度符合[9],与文献中描述巴尔喀什蘑菇的特征一致[8]。基因测序分析发现,野生蘑菇 (巴尔喀什)的ITS区序列与美味蘑菇(A.sinodeliciosusKM657914.1)、赭鳞蘑菇(A.subperonatus(KX505304.1)、A.desjardinii(KM657906.1) 菌株的同源序列覆盖率为99.5% 。野生蘑菇BHBC基因与A.balchaschensis的同源覆盖率达99.9%,系统发育树在同一节点,亲缘关系最近[10]。结合形态特征,该菌株BHBC为巴尔喀什蘑菇[8]。

野生巴尔喀什菇纯化后子实体漆酶为65kD单亚基蛋白,真菌漆酶的分子量一般在50～90 kD之间,符合担子菌漆酶[11]。 担子菌漆酶的N 端氨基酸序列具有很大的相似性[12],采自焉耆县野生巴尔喀什菇漆酶的N端氨基酸序列包括Ser、Gly 和Phe等氨基酸,与BasidiomycetePM1laccase、Pleurotusostreatuslaccase和Phlebiaradiatalaccase均包含SxGP序列相似度高[13]。

通常真菌漆酶的最适酶活反应pH 范围为3.5～6,最适作用温度为30～50℃,过高或过低的温度都会抑制漆酶活性[14]。研究得到的巴尔喀什蘑菇子实体漆酶pH值是2.2,最适温度40℃。较研究报道的大多数漆酶pH低,如云芝栓孔菌(Trametesversicolor)所产漆酶的最适 pH为3.8[15],多孔菌(Polyporus)为4.2[16],硬毛粗盖孔菌(Funaliatrogii)为6.0[17]。该漆酶属酸性活性漆酶,酸性环境适应性高于一般漆酶。金属离子耐受实验表明,所有种金属离子对该酶具有抑制作用,Cu2+对漆酶活性的有微弱的促进作用,与大多数漆酶研究结论相同,证明铜离子是漆酶活动中心。Zhuo 等[18]研究了几种金属离子对 P. ostreatus HAUCC 162 漆酶活性有所增加,其中Cu2+效果最为显著。 Hg2+抑制蘑菇漆酶作用最强,在浓度为5 mmol/L时酶活仅存6.94%,漆酶活性。铁离子、银离子及汞离子通常抑制漆酶的活性[19]。

蘑菇漆酶可以催化多种底物,代谢底物中对ABTS的催化作用最强,其次对苯二氧基酚和甲苯胺等苯环类物质。漆酶介导生物体内酚类物质氧化偶联合成降解木质素和黄酮类物质参与物质交换[20]。

4 结 论

4.1焉耆县采集的黑蘑菇是蘑菇属的巴尔喀什蘑菇,是一种大型野生食用菌。子实体漆酶通过硫酸铵沉淀、纤维素CM-cellulose阳离子、Q-Sepharose阴离子交换吸附纯化和Superdex 75凝胶过滤层析,得到纯化倍数为354.58倍,回收率是1.5%,分子量为65 kDa的单亚基蛋白。该漆酶N端的10个氨基酸序列为: SGGPEQNTTA,与糙皮侧耳和杂色云芝漆酶有相似中心。

4.2巴尔喀什蘑菇子实体漆酶具有较低的pH, 达2.2,最适温度为40℃,属于中低温性漆酶。金属离子Cu2 +对该漆酶对ABTS有轻微促进作用,Hg2 +对它有很强的抑制作用。该漆酶可以催化氧化多种底物,由强到弱主要有ABTS>二甲氧基酚>甲苯胺。