顶芒山羊草特异寡核苷酸探针开发和oligo-FISH核型构建

史培瑶 陈丽娟 孙昊杰 程梦豪 肖 进 袁春霞 王秀娥 王海燕

顶芒山羊草特异寡核苷酸探针开发和oligo-FISH核型构建

史培瑶 陈丽娟 孙昊杰 程梦豪 肖 进 袁春霞 王秀娥 王海燕*

南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 细胞遗传研究所/ 现代作物生产省部共建协同创新中心，江苏南京 210095

栽培小麦近缘物种顶芒山羊草(, 2=2=14, MM)是小麦改良的三级基因库。为准确鉴定顶芒山羊草M基因组染色体或染色体区段, 本研究利用二代测序获得顶芒山羊草M基因组序列信息, 从中鉴定出16条可能的特异卫星重复序列。根据这些序列设计12个寡核苷酸(oligo)探针进行oligo-FISH, 结果表明, 其中10个探针可在顶芒山羊草染色体上产生明显的杂交信号。对探针特异性分析发现, 5个探针仅在顶芒山羊草染色体上产生杂交信号, 在小麦染色体上未观察明显杂交信号, 可作为顶芒山羊草特异探针鉴定小麦背景中的顶芒山羊草染色体。选择在顶芒山羊草染色体上信号分布丰富的3个探针(oligo-pAc89、oligo-pAc148、oligo-pAc225)组成探针套ONPS#AC1, 结合利用本实验室根据小麦D亚基因组开发的寡核苷酸探针库, 构建了顶芒山羊草的oligo-FISH核型。本研究构建的FISH核型可以准确识别顶芒山羊草各条染色体, 为挖掘、转移和利用顶芒山羊草优异基因提供了快速准确的鉴定手段。

顶芒山羊草; 二代测序; 卫星重复序列; 寡聚核苷酸探针; 荧光原位杂交

顶芒山羊草(, 2=2=14, MM)是山羊草属二倍体物种, 是小麦的三级基因库。已有研究表明, 普通小麦D基因组遗传多样性最低, 而M基因组和D基因组遗传关系较近, M基因组导入小麦可以丰富小麦D基因组的遗传多样性[1-2]。顶芒山羊草具有抗小麦条锈病[3]、叶锈病和白粉病[4]、抗小麦孢囊线虫病[5]、小麦瘿蚊病、小麦蚜虫[4]以及耐盐等优良性状[6], 是小麦遗传改良的重要基因资源。利用远缘杂交和染色体工程可以将顶芒山羊草的优异基因导入到普通小麦[7]。已有研究报道将M基因组抗秆锈病、条锈病等基因导入了栽培小麦[3]。Zuo等[8]利用四倍体小麦-顶芒山羊草双二倍体STM4与中国春(CS)、博紫1313 (BZ1313)、川农16 (CN16, 含1BL/1RS易位)进行复合杂交, 选育了两个高抗白粉病的普通小麦-顶芒山羊草7M(7A)二体代换系, 推测7M染色体携带抗小麦白粉病基因。Liu等[7]利用创制的一套小麦-顶芒山羊草的染色体系(其中包括6个2M-7M小麦-顶芒山羊草二体异附加系DA2M-DA7M, 1个小麦-顶芒山羊草二体异代换系DS6M(6A)), 推测顶芒山羊草的2M和7M染色体可能分别携带抗小麦条锈病和白粉病基因。

利用染色体工程转移近缘物种优异基因过程中,快速准确的鉴定外源染色质是种质创新的关键手段。随着麦类植物等基因组学的快速发展, 已经快速发展出基因组原位杂交(genomichybridization, GISH) 、荧光原位杂交(fluorescencehybridization, FISH)和基于简单重复序列、单核苷酸多态性等分子标记的外源染色质鉴定技术[9-13]。例如, 宫文萍等[14]利用oligo-FISH分别对顶芒山羊草、无芒山羊草与普通小麦的双二倍体进行分析, 结果发现, (GAA)8重复序列探针可用于鉴定小麦背景中的顶芒山羊草各染色体。Parisod和Badaeva[15]利用重复序列探针pAs1、pSc119.2、pTa535等对部分山羊草属物种进行分子细胞遗传学核型分析, 结果表明, pAs1探针可以在顶芒山羊草染色体上产生丰富的信号。Song等[16]利用寡核苷酸探针pSc119.2、pTa71结合(AAC)5, (ACT)7和(CTT)12构建了顶芒山羊草的FISH核型并进行了染色体结构多样性的分析。目前, 在顶芒山羊草染色体鉴定研究中, 利用的重复序列探针来源于其他物种, 对顶芒山羊草染色体无特异性, 而且目前基于重复序列信息开发的FISH探针只在染色体一些特定区域如长短臂的端部或着丝粒区域产生较为局限的点状信号, 不能覆盖整条染色体, 因此, 对染色体重排等的鉴定具有一定局限性[17]。因此, 迫切需要基于顶芒山羊草基因组信息, 开发顶芒山羊草特异的oligo探针, 提高顶芒山羊草染色质的鉴定精度、特异性和效率。

近年来, 基于单拷贝探针库的染色体涂染(oligo- painting)技术大大提高了鉴定的效率、准确度和精度。目前, 该技术已成功应用于特定染色体的识别、核型构建等方面[18-20]。Han等[21]基于单拷贝基因序列开发了黄瓜3号染色体长臂和短臂特异的寡核苷酸探针库, 利用该套探针对黄瓜及其近缘种的特定染色体进行了涂染。该项技术也在小麦族物种中已经得到应用。本实验室Song等[22]根据已完成测序的小麦品种中国春的参考基因组序列, 开发了4D染色体特异的寡核苷酸探针库, 首次在小麦上建立了染色体涂染技术, 同时发现4D染色体特异的寡核苷酸探针库也可以在顶芒山羊草的4M染色体产生信号。Li等[23]基于小麦A、B、D基因组和大麦H基因组序列比较分析(序列相似性>96%), 开发了一套1～7部分同源群的oligo探针, 可用于小麦族不同属种间染色体的识别和比较基因组学探究。

本研究利用TAREAN软件在顶芒山羊草二代测序基因组中, 鉴定特异重复序列, 根据重复序列基序开发寡核苷酸(oligo)探针, 通过oligo-FISH筛选顶芒山羊草特异oligo-探针; 利用特异oligo-探针和前期开发的普通小麦D亚基因组特异oligo-painting探针, 构建顶芒山羊草M基因组染色体FISH核型, 完善顶芒山羊草染色体鉴定体系, 为挖掘和利用顶芒山羊草的优异基因提供有效的细胞学手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

顶芒山羊草(, 2=14, 基因组MM, 登录号为PI551063、PI542176); 小伞山羊草(, 2=14, 基因组UU, 登录号为PI276994); 单芒山羊草(, 2=14, 基因组NN, 登录号为PI554418); 节节麦(, 2=14, 基因组DD, 登录号为PI511362); 拟斯卑尔脱山羊草(, 2=14, 基因组SS, 登录号为PI560750), 大麦(, 2=14, 基因组HH, 登录号为PI542176); 黑麦(, 2=2=14, 基因组RR, 登录号为PI542176); 以上小麦野生近缘物种引自美国国家植物种质资源库(NPGSUSA)。簇毛麦(, 2=14, 基因组VV, 登录号为91C43), 引自英国剑桥植物园; 普通小麦中国春(Chinese Spring, CS)由南京农业大学细胞遗传研究所(CINAU)保存。

1.2 二倍体顶芒山羊草的基因组测序

采用CTAB法提取顶芒山羊草(PI551063)幼叶基因组DNA[24]。通过DNA片段化、末端修复、连接和PCR扩增构建DNA文库, 利用Agilent 2100进行DNA文库质量控制后, 利用双末端测序法进行BGISEQ-500测序(委托中国深圳BGI公司完成), 获得的原始序列去除低质量、低复杂度、短于35 bp的reads序列, 得到高质量测序数据用于进一步分析。

1.3 重复序列鉴定和oligo探针开发

重复序列鉴定参照程梦豪等[25]的方法。利用重复序列分析软件RepeatExplorer 2 (http://www. repeatexplorer.org/)对所有reads进行串联重复序列分析, 经序列聚类和拼接, 得到M基因组重复序列信息。利用oligo 7寡聚核苷酸探针设计软件[26], 将鉴定出的上述卫星DNA序列设计成(55±4) bp的寡聚核苷酸探针, 每个重复序列开发1个oligo探针, 设计好的探针序列由擎科生物公司合成, 在探针的5¢末端用6-FAM (绿色荧光)或TAMRA (红色荧光)荧光基团对设计的寡聚核苷酸探针进行荧光修饰。

卫星重复序列和探针命名: 本研究重复序列命名为pAc (p代表探针, Ac代表顶芒山羊草的属名和种名的首字母)+重复序列聚类簇的编号。例如, 来自M基因组的重复序列cluster89的命名为pAc89; 基于该重复序列开发的oligo探针相应命名为oligo- pAc89; 用于核型构建的3个探针oligo-pAc89、oligo-pAc148、oligo-pAc225所组成的探针套命名为ONPS#AC1 (oligonucleotide probe set of), 其中3个探针的用量比例为1︰1︰1。

1.4 有丝分裂中期染色体制片

染色体中期同步化处理参照Song等[22]的方法。根尖细胞中期染色体制片使用的滴片法参照Lei等[27]的方法。

1.5 寡核苷酸探针的荧光原位杂交(oligo-FISH)

oligo-FISH在Lei等[27]的基础上稍作修改。制片首先在紫外交联仪中交联1～4 min, 强度为0.125 J cm–2。然后将交联后的染色体制片在含0.15 mol L–1NaOH的70%酒精溶液中变性5 min, 随后依次在70%、90%和100%的酒精中梯度脱水5 min, 晾干备用。将15mL的杂交液滴加在制片上, 杂交液组成: 7.5 μL甲酰胺(Formamide, FA), 1.5 μL缓冲液(20× SSC), 0.5 μL鲑鱼精DNA (Salmon sperm DNA, ssDNA), 10 pmol oligo探针, 然后用ddH2O补足至15 μL。盖上盖玻片, 置于湿盒, 37℃杂交6 h以上; 杂交后的制片在ddH2O中洗10 min (42℃水浴), 气干; 滴加7mL含DAPI的H1200 (VECTA)防荧光淬灭剂, 盖上盖玻片; 将制片放于Olympus BX51型荧光显微镜下暗环境进行镜检, 并用Olympus DP72型CCD相机照相。

1.6 染色体涂染荧光原位杂交(oligo-painting FISH)

染色体涂染实验所用的探针是本实验室利用中国春的参考基因组序列开发的中国春D亚基因组染色体特异oligo-painting探针。oligo-painting参照Song等的方法[22]。交联后的染色体制片每张滴加100mL的胃蛋白酶稀释液, 放置于湿盒中处理1 h, 之后用2×SSC缓冲液在室温下洗涤3次, 每次5 min;接下来分别移至70%、90%和100%的酒精中梯度脱水3 min; 滴加100 μL 70%甲酰胺(dFA)于制片上, 盖上盖玻片, 迅速放入88℃杂交仪中变性4 min; 变性后, 分别在–20℃预冷的70%、90%和100%酒精中梯度脱水, 每次5 min, 气干; 杂交液的配制: 10 μL去离子甲酰胺(100% dFA), 2 μL 20×SSC, 4 μL 50%硫酸葡聚糖(50% DS), 6 μL寡核苷酸探针(200 ng μL–1); 将杂交液滴加在气干的染色体制片上, 盖上盖玻片, Elmers胶封边缘, 37℃杂交2 d左右。将杂交后的制片放置于2×SSC缓冲液中室温下洗涤5 min, 移至42℃预热的2×SSC中洗涤10 min, 之后在1×PBS缓冲液中室温下洗涤5 min; 配制检测液: 每张片子准备2 μL Anti-Dig-罗丹明+80 μL TNB用于地高辛标记的红色探针的信号检测; 将配好的检测液充分混匀, 滴加在气干的染色体制片上, 盖上盖片, 37℃孵育2 h, 之后在1×PBS中洗涤3次, 每次5 min, 气干。滴加6.5 μL每张含DAPI的H1200 (VECTA)防荧光淬灭剂, 盖上洁净的盖玻片, 在Olympus BX53型荧光显微镜下镜检, Olympus DP81型CCD相机照相。

2 结果与分析

2.1 顶芒山羊草M基因组特异重复序列筛选

对利用RepeatExplorer2 (http://www.repeatexplorer.org/)鉴定出顶芒山羊草的串联重复序列进行聚类和拼接, 共获得可能的M基因组特异卫星重复序列16条, 其中8条高置信度重复序列, 8条低置信度重复序列(表1)。在鉴定的重复序列中, 基序最长的是CL149, 为663 bp, 占M基因组0.1%; 基序最短的是CL225, 为46 bp, 占M基因组0.028%; 其余14条序列的基序长度范围49～637 bp, 占M基因组的0.03%～0.28%。

将上述重复序列的基序在NCBI数据库进行BLASTN (Percent Identity≥80%, Query Coverage≥80%)序列比对发现, 其中4条(CL103、18S、CL133和CL115)基序与已知的重复序列相同, 推测它们是不同物种中较保守的序列; 6条序列可以比对到已知的同源序列, 其中, CL301与小麦的重复序列pTa713、pTa885、pTa551、pTa779相似, CL238与节节麦的重复序列4P6-14、4P6-9和4P6-2相似, 另外4条序列(CL89、CL149、CL198、CL225)分别与小麦中的1740-J17、1716-E15、190H5、醇溶蛋白相关、醇溶蛋白相关3B BAC和同源, 均不是典型的串联重复序列; 6条序列(CL105、CL146、CL148、CL217、CL259、CL263)未比对到已知同源序列, 推测可能是M基因组特异重复序列(表1)。

2.2 oligo探针开发及其基因组特异性分析

利用oligo 7寡聚核苷酸设计软件[27]开发了基于上述12条卫星DNA序列的oligo探针: oligo-pAc89、oligo-pAc105、oligo-pAc146、oligo-pAc148、oligo- pAc149、oligo-pAc198、oligo-pAc217、oligo-pAc225、oligo-pAc238、oligo-pAc259、oligo-pAc263和oligo- pAc301, 基序介于51～59 bp (表1)。

表1 开发的12个oligo探针的序列信息

利用开发的探针在顶芒山羊草和小麦品种中国春中进行oligo-FISH, 结果表明, oligo-pAc146和oligo-pAc198在2个材料中均未观察到明显杂交信号。oligo-pAc105、oligo-pAc148、oligo-pAc149、oligo-pAc217和oligo-pAc259可在顶芒山羊草染色体上产生明显杂交信号, 而在中国春染色体上未观察到明显信号, 推测这5个探针可作为M基因组特异探针识别小麦背景中的M基因组染色体(图1)。oligo-pAc149、oligo-pAc217和oligo-pAc259分别在顶芒山羊草的1对染色体上产生杂交信号; oligo- pAc148可在顶芒山羊草的12条染色体上产生杂交信号。oligo-pAc89、oligo-pAc225、oligo-pAc238、oligo-pAc263、oligo-pAc301在顶芒山羊草和中国春染色体上均可产生杂交信号(图2), 但信号分布和数量存在差异, oligo-pAc89、oligo-pAc301、oligo- pAc225、oligo-pAc238和oligo-pAc263分别在顶芒山羊草的12条、8条、6条、4条、2条染色体上有杂交信号, oligo-pAc301、oligo-pAc89、oligo-pAc238、oligo-pAc225、oligo-pAc263分别在中国春的28条、12条、12条、10条和6条染色体上有杂交信号。oligo-pAc89、oligo-pAc148、oligo-pAc225和oligo- pAc301在顶芒山羊草染色体上产生的杂交信号较丰富, oligo-pAc238在顶芒山羊草的6条染色体上产生信号, 而oligo-pAc105、oligo-pAc149、oligo-pAc217、oligo-pAc263和oligo-pAc259只在顶芒山羊草的2条染色体上产生杂交信号。

图1 5个oligo探针在顶芒山羊草(PI542176)和中国春有丝分裂中期染色体的oligo-FISH

A1, A2: 探针oligo-pAc105; B1, B2: 探针oligo-pAc259; C1, C2: 探针oligo-pAc149; D1, D2: 探针oligo-pAc217; E1, E2: 探针oligo- pAc148。染色体用DAPI套染(蓝色); 5个寡聚核苷酸探针用5′TAMRA修饰(红色)。标尺为10 μm。

A1, A2: probe oligo-pAc105; B1, B2: probe oligo-pAc259; C1, C2: probe oligo-pAc149; D1, D2: probe oligo-pAc217; E1, E2: probe oligo-pAc148. Chromosomes were counterstained with DAPI (blue); five oligo probes were modified with 5′TAMRA (red). Bar: 10 μm.

A1, A2: 探针oligo-pAc263; B1, B2: 探针oligo-pAc225; C1, C2: 探针oligo-pAc238; D1, D2: 探针oligo-pAc301; E1, E2: 探针oligo- pAc89。染色体用DAPI套染(蓝色); 探针oligo-pAc225、oligo-pAc238和oligo-pAc263用5′TAMRA修饰(红色); 探针oligo-pAc89和oligo-pAc301用5′FAM修饰(绿色)。标尺为10 μm。

A1, A2: probe oligo-pAc263; B1, B2: probe oligo-pAc225; C1, C2: probe oligo-pAc238; D1, D2: probe oligo-pAc301; E1, E2: probe oligo-pAc89. Chromosomes were counterstained with DAPI (blue); oligo probes oligo-pAc225, oligo-pAc238, and oligo-pAc263 were modified with 5′TAMRA (red), and oligo-pAc89 and oligo-pAc301 were modified with 5′FAM (green). Bar: 10 μm.

为验证这5个oligo探针(oligo-pAc105、oligo- pAc148、oligo-pAc149、oligo-pAc217和oligo-pAc259)对于顶芒山羊草的特异性, 利用B2DSC[28](= 85,= 80)分析了探针序列在中国春参考基因组中的拷贝数和物理位置。分析发现oligo-pAc105未能搜索到同源序列, 其余4个探针序列可以比对到同源序列, 但数量和位置分布不同。oligo-pAc149和oligo-pAc217同源序列在中国春基因组的不同区域预测的拷贝数很少, 且散在分布在各条染色体上; oligo-pAc148同源序列仅局限于中国春基因组的小麦4A染色体和4B染色体端部的1 Mb之内; oligo- pAc259同源序列或仅局限于中国春基因组染色体的1 Mb之内, 或虽是集中分布、但平均在每1 Mb内的同源序列数很少。由此可见, 这些探针在中国春基因组中或散在分布且拷贝数较低, 或仅集中分布于1 Mb基因组区间, 推测由此导致这些探针无法在中国春染色体上产生FISH信号。

利用探针oligo-pAc105、oligo-pAc148、oligo- pAc149、oligo-pAc217和oligo-pAc259在7个二倍体小麦近缘物种进行oligo-FISH, 结果发现, oligo- pAc217在7个物种中均未产生杂交信号; oligo- pAc148、oligo-pAc105、oligo-pAc149和oligo-pAc259在小伞山羊草U基因组、拟斯卑尔脱山羊草S基因组和大麦H基因组上均无杂交信号, 但可以在其他基因组上产生杂交信号; oligo-pAc148在单芒山羊草N基因组、簇毛麦V基因组、黑麦R基因组产生杂交信号; oligo-pAc105在单芒山羊草N基因组上产生杂交信号; oligo-pAc149和oligo-pAc259在节节麦D基因组上产生杂交信号(图3)。比较5个探针在7个二倍体小麦近缘物种中的oligo-FISH分析结果发现, 探针oligo-pAc105和oligo-pAc148可在单芒山羊草N基因组的部分染色体产生杂交信号; 探针oligo- pAc149和oligo-pAc259可在节节麦D基因组的部分染色体产生杂交信号。据此我们推测顶芒山羊草M基因组与单芒山羊草的N基因组和节节麦的D基因组亲缘关系较近, 这与已知的顶芒山羊草与节节麦和单芒山羊草亲缘关系相符合。但我们也发现, 探针oligo-pAc148在簇毛麦V基因组、黑麦R基因组的部分染色体也产生杂交信号, 这与已知的顶芒山羊草与簇毛麦和黑麦的亲缘关系不一致。oligo- pAc217探针的特异性最好, 其余4个探针不仅能鉴定顶芒山羊草M基因组染色体, 也在鉴定单芒山羊草、黑麦、簇毛麦和节节麦染色体上有应用潜力。

2.3 顶芒山羊草的oligo-FISH核型构建和M基因组染色体识别

利用本实验室开发的中国春D亚基因组染色体特异oligo-painting探针对顶芒山羊草进行oligo- painting, 根据1D～7D各探针在M基因组杂交信号, 可以区分1M～7M染色体。利用本研究开发的3个oligo (oligo-pAc89、oligo-pAc148和oligo-pAc225)探针组合, 用FAM标记组成为绿色荧光探针套ONPS#AC1, 对顶芒山羊草进行oligo-FISH, 获得1M～7M 7对染色体FISH信号特征, 构建了顶芒山羊草染色体oligo-FISH核型(图4)。结果表明, 该探针套可以在7对M基因组染色体上分别产生可分辨的FISH信号特征, 可彼此区分开来。其中, 1M的着丝粒区域有较强的FISH信号, 长臂顶端有一较弱的FISH信号; 2M的长臂顶端和中部区域分别有一较弱的和中等强度FISH信号; 3M的短臂和长臂顶端各有一个较弱的FISH信号, 其着丝粒区域有中等强度FISH信号; 4M的短臂顶端和近顶端、长臂顶端各有较弱的FISH信号, 短臂近着丝粒区域FISH信号较强; 5M的FISH信号较弱, 仅在长臂近着丝粒区域和中部分别有较弱的FISH信号; 6M的FISH信号也较弱, 在短臂顶端有较弱的FISH信号, 着丝粒区域和长臂近着丝粒区域信号更弱; 7M的短臂近着丝粒区域的FISH信号强度最大, 着丝粒区域、长臂近着丝粒区域和长臂与短臂末端各有较弱的FISH信号。

(图3)

A1–A7: 探针oligo-pAc105; B1–B7: 探针oligo-pAc148; C1–C7: 探针oligo-pAc149; D1–D7: 探针oligo-pAc217; E1–E7: 探针oligo- pAc259。染色体用DAPI套染(蓝色); 5个寡聚核苷酸探针用5′TAMRA修饰(红色)。标尺为10 μm。

A1–A7: probe oligo-pAc105; B1–B7: probe oligo-pAc148; C1–C7: probe oligo-pAc149; D1–D7: probe oligo-pAc217; E1–E7: probe oligo-pAc259. Chromosomes were counterstained with DAPI (blue); five oligo probes were modified with 5′TAMRA (red). Bar: 10 μm.

(图4)

A: 1M～7M信号组合图, 红色为中国春D亚基因组染色体特异寡核苷酸探针涂染信号, 绿色为ONPS#AC1信号, 白色箭头示寡核苷酸探针涂染的染色体; B: 图A中剪切的1M～7M每条染色体的组合图; C: 从图B中分离出的1M～7M各染色体的中国春D亚基因组染色体特异寡核苷酸探针涂染信号图; D: 从图B中分离出的1M～7M每条染色体的ONPS#AC1信号图, 标尺为10 μm; E: 顶芒山羊草的核型模式图。

A: the merged signals of chromosome 1M–7M using oligo-painting of sub-genome D chromosome specific oligo-painting probes (red) and oligo-FISH using ONPS#AC1 (green), white arrow points to the painted chromosome with oligonucleotide probe; B: the merged figures of 1 M–7M cutting from (A); C: the oligo-painting FISH signals digitally separated from (B); D: the oligo-FISH using ONPS#AC1 signals digitally separated from (B); E: the oligo-FISH karyotype of. Bars: 10 μm.

进一步分析了5个探针(oligo-pAc105、oligo- pAc148、oligo-pAc149、oligo-pAc217和oligo-pAc259)在顶芒山羊草各染色体上的分布特征。将探针套ONPS#AC1分别与上述5个探针组合进行oligo- FISH (图5), 结果发现, oligo-pAc105和oligo-pAc259探针产生的信号较强, 都位于4M染色体的短臂顶端, 它们可用于特异识别4M染色体; oligo-pAc148在除2M染色体之外的12条染色体长臂和短臂的顶端均产生较强的FISH信号; oligo-pAc149在3M染色体长臂近着丝粒区域有较强的FISH信号, 在6M染色体短臂顶端信号较弱, 可用于特异的识别3M和6M染色体; oligo-pAc217在7M染色体短臂近着丝粒区域有较强的信号, 可用于特异识别7M染色体。

3 讨论

染色体分带技术在经典细胞遗传学研究中发挥了重要作用, 但如果外源片段没有特征带型或不显带或带型跟受体材料的带型无明显差异时, 分带技术在识别外源染色质方面则很难发挥较大的作用。另外, 染色体分带技术操作步骤繁琐、需要较高的实验技能, 难以进行高效的筛选和识别染色体的结构变异。

基因组原位杂交和荧光原位杂交是鉴定特定染色体组来源或追踪外源染色体片段的有效手段。近年来发展起来的基于寡核苷酸探针的FISH (oligo- FISH) 技术已经成为染色体研究的重要手段。利用合成寡核苷酸探针的oligo-FISH, 不仅在探针开发和合成方面减少了繁琐的步骤, 降低了成本, 同时也简化了原位杂交的程序。在小麦中, 开发了串联序列重复(SSR)寡核苷酸探针, 例如oligo- pSc119.2、oligo-pTa535、oligo-k566、oligo-713和oligo-pAs1等常用探针, 用于FISH核型构建和识别小麦染色体[29-33]。在小麦中常用的重复序列探针, 如oligo-pAs1, oligo-pSc119.2, Afa家族, (AAC)5、(GAA)n, oligo-pTa535和oligo-pTa71已被用于二倍体顶芒山羊草物种以及小麦-顶芒山羊草双二倍体的FISH核型分析, 但这些探针在顶芒山羊草中的信号丰富度较为多变, oligo-pSc119.2、oligo-pTa535和oligo-pTa71均只在顶芒山羊草的某些染色体上产生信号, 不能清楚的区分7对顶芒山羊草。对于涉及顶芒山羊草与小麦的异染色质材料, (GAA)n不仅在背景小麦染色体上产生丰富的FISH信号, 还可以在顶芒山羊草的染色体产生丰富且与小麦相似的FISH信号, 降低对顶芒山羊草染色质识别的准确度。因此, 开发顶芒山羊草特异的重复序列探针不但可以识别小麦背景中的外源染色体, 还可以区分顶芒山羊草的各条染色体; 同时, 将开发的顶芒山羊草特异探针与其他重复序列探针或基因组探针结合使用, 可大大提高对涉及顶芒山羊草的外源种质材料的鉴定准确性。

图5 5个oligo探针分别与绿色荧光探针套相结合分别在顶芒山羊草(PI542176)有丝分裂中期染色体的oligo-FISH

A: 探针oligo-pAc105; B: 探针oligo-pAc148; C: 探针oligo-pAc149; D: 探针oligo-pAc217; E: 探针oligo-pAc259; 染色体用DAPI套染(蓝色)。5个寡聚核苷酸探针用5’TAMRA修饰(红色); 绿色为ONPS#AC1信号。标尺为10 μm。

A: probe oligo-pAc105; B: probe oligo-pAc148; C: probe oligo-pAc149; D: probe oligo-pAc217; E: probe oligo-pAc259. Chromosomes were counterstained with DAPI (blue); five oligo probes were modified with 5’TAMRA (red). ONPS#AC1 probewas modified with 5’FAM (green). Bars: 10 μm.

伴随着基因组测序技术的发展和越来越多物种全基因组序列发布, 利用生物信息学分析筛选物种特异重复序列、开发物种或基因组特异FISH探针成为可能。本研究利用TAREAN从顶芒山羊草的测序数据中鉴定出卫星重复序列并开发成oligo探针, 通过与小麦参考基因组的序列比对结合oligo-FISH,成功开发了顶芒山羊草特异探针。本实验室Song等[22]根据普通小麦中国春的参考基因组序列开发了4D染色体特异的寡核苷酸染色体涂染探针, 这个探针可以成功的识别顶芒山羊草的4M染色体。本实验室进一步开发了小麦D亚基因组各染色体特异的寡核苷酸涂染探针, 利用该套探针可以成功的识别顶芒山羊草的1M～7M染色体。因此, 将oligo- painting技术和oligo-FISH技术结合起来, 发挥两者各自的优势, 可以准确的构建顶芒山羊草的FISH核型。本研究首先利用oligo-painting探针在染色体准确识别方面的优势, 先识别出顶芒山羊草的各染色体; 然后在此基础上利用新开发的顶芒山羊草特异的oligo-FISH探针来构建其核型, 基于此方法构建的核型, 可以提高顶芒山羊草染色体识别的精度, 可以弥补之前利用小麦核型模式图来识别顶芒山羊草各染色体的缺陷。

4 结论

本研究基于顶芒山羊草的二代测序数据开发出10个能在顶芒山羊草上产生信号的寡核苷酸探针, 其中5个探针可用于鉴定小麦背景中特定的顶芒山羊草染色体。选择3个探针组成探针套与普通小麦D亚基因组特异的染色体涂染探针结合构建了顶芒山羊草的FISH核型, 该核型可以准确识别顶芒山羊草各条染色体。

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Development of specific oligonucleotide probe library ofand construction of oligo-FISH karyotype

SHI Pei-Yao, CHEN Li-Juan, SUN Hao-Jie, CHENG Meng-Hao, XIAO Jin, YUAN Chun-Xia, WANG Xiu-E, and WANG Hai-Yan*

National Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement and Utilization / Cytogenetics Institute / Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production Co-sponsored by Province and Ministry (CIC-MCP), Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

(, 2=2=14, MM) is a tertiary gene bank for wheat improvement. In order to accurately identify the chromosomes ofM genome or the chromosome segments transferred into wheat, the next-generation sequencing information ofM genome were obtained. Based on the next-generation sequencing information ofM genome, 12 oligonucleotide probes were designed for oligo-FISH analysis according to the 16 possible specific satellite repeats identified. The oligo-FISH results showed that ten of the probes could produce obvious hybridization signals on the chromosomes of. The probe specificity analysis revealed that the five probes generated hybridization signals on the chromosomes of, but there was no obvious hybridization signal on the chromosomes in wheat, which used as the specific probes to identify the chromosomes or chromosome segments of M genome in wheat background. Three probes (oligo-pAc89, oligo-pAc148, and oligo-pAc225) with abundant signal distribution on the chromosomes ofwere selected to form a probe set named ONPS#AC1. Combined with the oligonucleotide probe library developed according to wheat D sub genome, the oligo-FISH karyotype ofwas constructed, which can accurately identify each chromosome of the M genome, providing an important molecular cytogenetic basis for mining, transferring, and utilizing the excellent genes of.

; second-generation sequencing; satellite repeats; Oligo nucleotide probe; fluorescencehybridization

10.3724/SP.J.1006.2023.21048

本研究由国家重点研发计划项目(2020YFE0202900), 中央高校基本科研业务费(KYZZ2022003), 江苏省现代农业产业技术体系(JATS[2021]463)和江苏省种业振兴项目(JBGS[2021]006, 013, 047)资助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2020YFE0202900), the Fundamental Research Funds for the Central University (KYZZ2022003), the Jiangsu Province Modern Agricultural Industry Technology System (JATS[2021]463), and the Seed Industry Revitalization Project of Jiangsu Province (JBGS[2021]006, 013, 047).

王海燕, E-mail: hywang@njau.edu.cn

E-mail: 2019101115@njau.edu.cn

2022-07-06;

2022-10-10;

2022-10-21.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20221020.1828.002.html

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