柑橘大实蝇气味结合蛋白BminOBP6与其气味配体的互作机制

2023-04-10杨岭田晓丽桂连友王福莲张国辉

中国农业科学 2023年7期

杨岭，田晓丽，桂连友，王福莲，张国辉

杨岭1，田晓丽2，桂连友1，王福莲1，张国辉1

1长江大学农学院，湖北荆州 434025；2长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025

【】通过构建柑橘大实蝇（）BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6），比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力，检测在不同pH条件下二者对气味配体结合能力的差异，为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考。【】通过在线工具SWISS MODEL对BminOBP6进行同源建模，根据构建的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个螺旋（6）之后的C末端序列；设计特异性引物扩增BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6）的编码序列，即；构建重组表达载体pET32a/，将此重组载体与实验室保存的重组载体pET32a/分别转入原核细胞BL21（DE3）中，异源表达野生型BminOBP6及其突变体TOBP6；以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合试验，检测BminOBP6和TOBP6在两种pH环境（pH 7.4和pH 5.0）下对1-十一醇和(+)-柠檬烯的结合能力。【】序列比对结果显示，BminOBP6与致倦库蚊（）CquiOBP1的序列具有很高的相似性，为62.6%，远高于30%，因此选择以CquiOBP1的3D结构作为BminOBP6同源建模模板。模型显示BminOBP6的6之后是由8个氨基酸残基（D117—P124）组成的C末端序列，即将被切除的C末端序列。在此基础上设计引物克隆获得了编码TOBP6的cDNA序列，并构建了其重组表达载体pET32a/，该重组载体和pET-32a/重组载体分别转入大肠杆菌细胞中进行了异源表达。荧光竞争结合试验结果显示，在pH为7.4时，BminOBP6与1-十一醇和(+)-柠檬烯具有很强的结合能力，ki值分别为6.89和9.50 μmol·L-1。当pH降至5.0时，BminOBP6却丧失了对1-十一醇的结合能力，同时与(+)-柠檬烯的结合能力也大幅减弱，ki值从9.50 μmol·L-1升至31.26 μmol·L-1；而不论在何种pH条件下，TOBP6均丧失了对这两种气味配体的结合能力。【】pH在柑橘大实蝇 BminOBP6与其配体结合和释放过程中发挥了重要作用，并且BminOBP6的C末端在配体的结合中起着关键作用。

柑橘大实蝇；气味结合蛋白；同源建模；C末端；原核表达；荧光竞争结合

0 引言

【研究意义】柑橘大实蝇（）属于双翅目（Diptera）实蝇科（Tephritidae）[1]，是一种危害柑橘类果实的重要害虫[2]。柑橘大实蝇主要以幼虫钻蛀危害果实，严重影响果品的产量和品质。由于这种虫害的隐蔽性，使得化学防治效果不佳，另外长期施用化学农药，容易造成害虫抗药性，同时农药的残留也易引起环境问题[3-4]。利用昆虫的嗅觉进行害虫防治是一项高效、环保的技术。因此，针对柑橘大实蝇对气味信息素的嗅觉识别机制，深入研究柑橘大实蝇气味结合蛋白（odorant-binding protein，OBP）与其配体的互作机制，不仅有利于揭示柑橘大实蝇的嗅觉识别机制，而且可为研发针对柑橘大实蝇嗅觉的行为调控技术提供理论依据。【前人研究进展】多数昆虫都具有敏感又精密的嗅觉系统，这一系统在昆虫众多的生命活动中发挥着重要作用，比如寻找寄主、交配、觅食、躲避天敌和寻找产卵地点等[5-6]。昆虫对外界气味信息素的识别是一个复杂的过程，涉及众多蛋白，主要包括OBP、气味受体（olfactory receptor，OR）、离子受体（inotropic receptor，IR）、感觉神经元膜蛋白（sensory neuron membrane protein，SNMP）和气味降解酶（odorant degrading enzyme，ODE）[7-12]。OBP是一类小分子量、亲水性分泌蛋白质。它能够识别、结合进入感受器内的脂溶性气味分子，并携带气味分子穿过水性感器淋巴液，运输至位于嗅觉神经元树突膜上的OR，从而使化学信号转变为电信号[7,13-14]。由此可见，OBP与气味信息素的识别处于整个嗅觉信号转导通路的最前端，理解OBP与气味信息素的结合机制对于阐释昆虫整个嗅觉系统至关重要，因此，对昆虫OBP的研究是目前该领域研究的热点之一。大量实验证据也表明OBP在昆虫气味识别过程中发挥着重要作用。例如，对cis-vaccenyl acetate（cVA）反应敏感的野生型果蝇（）中的气味结合蛋白LUSH进行突变体试验时，LUSH缺失突变体果蝇对cVA完全失去敏感性[15]。在冈比亚按蚊（）中，利用dsRNA使沉默，通过EAG检测显示，冈比亚按蚊对吲哚的反应几乎消失[16]。同样，沉默和的豌豆蚜（）失去了对其报警信息素()--farnesene（EBF）的感受能力[17]。尽管越来越多的研究证明了OBP在昆虫嗅觉识别过程中的功能，然而有关昆虫OBP与其气味配体间的互作机制至今仍未有定论。起初，基于OBP分子晶体结构的研究，学者们提出了气味分子与OBP相互作用的观点[18-19]。经典的OBP通常存在6个高度保守的半胱氨酸，它们两两形成的二硫键成为维持蛋白质三级结构的重要部分。同时也经过6个螺旋与众多折叠、转角和无规卷曲一同形成复杂的空间结构，其中心一般为疏水性的结合腔，以便于配体的结合与运输。例如，对家蚕（）BmorPBP1与蚕蛾醇结合复合体晶体结构的研究发现，BmorPBP1分子中的螺旋1、3、4、5和6围成一个配体结合腔，配体蚕蛾醇就位于该结合腔内[20]。而且发现BmorPBP1有一个长链的C末端，在pH=4.5时，长链C末端形成一个额外的螺旋占据结合腔排挤出配体，即“释放”配体；而当pH=7.0时，此螺旋从结合腔中脱离，此时空置的结合腔用于结合配体[21]。这种OBP与配体的互作机制，在鳞翅目昆虫中比较多见，例如舞毒蛾（）LdisPBP[22]、多音天蚕蛾（）ApolPBP[23-24]和脐橙螟（）AtraPBP1[25]。而其他目的昆虫，虽然它们的OBP并非都具有如鳞翅目昆虫般的长链C末端，但可能有着不同的结合与释放配体的机制。例如，在双翅目蚊科昆虫中，其C末端更像一个盖子，当配体进入结合腔后，C末端上的氨基酸残基与OBP分子中第1个螺旋（1）和第3个螺旋（3）上的氨基酸残基形成pH敏感的分子内氢键，这样C末端就被锁定在结合腔的开口处，进而把配体关闭于结合腔内。当环境pH降低时，氢键被破坏，盖子打开，配体被释放[26-28]。从以上两种pH诱导的OBP与配体的互作模式来看，C末端在此过程中发挥了重要作用。因此学者们通过构建敲除C末端的OBP突变体，比较突变体与野生型OBP在结合气味配体能力上的差异，但并未得到一致的结果。比如，当C末端被切除后，腰带长体茧蜂（）McinOBP4和舞毒蛾LdisPBP2对其气味配体的结合能力显著下降[22,29]。但在BmorPBP[30]、AtralPBP[25]和棉铃虫（）HarmPBP1[31]中，C末端的切除并未影响这些OBP与其配体的结合能力，甚至升高。以上这些差异表明不同OBP与其配体的互作机制存在差异。【本研究切入点】实验室前期研究结果表明，柑橘大实蝇BminOBP6对(+)-柠檬烯、1-十一醇有很强的结合能力[32]，但是有关BminOBP6与这些气味配体的结合与释放机制仍不清楚。【拟解决的关键问题】通过构建柑橘大实蝇气味结合蛋白BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6），比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力，同时检测在不同pH条件下二者对配体结合能力差异，为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考。

1 材料与方法

试验于2021年10月至2022年11月在长江大学农学院昆虫生理生化实验室完成。

1.1 供试昆虫

供试柑橘大实蝇均来自长江大学农学院昆虫化学生态实验室。

1.2 主要试剂与仪器

TM（TMVersion 2.0）、DL2000 DNA Marker、H I、d III、T4 DNA Ligase均购自宝生物工程（大连）有限公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit，Omega；pGEM-T easy vector，Promega；Trans5感受态细胞、BL21（DE3）感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司；T100TMPCR仪、Gel DocXR+凝胶成像系统，BIO-RAD；Scientz-IID超声波细胞粉碎机，宁波新芝；Ni-NTA His·Bind Resin纯化树脂，上海七海复泰生物科技有限公司；重组肠激酶（enterokinase），上海近岸科技有限公司；12.5% SDS-PAGE彩色凝胶快速配胶试剂盒（红色），武汉普美克生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；F-7000荧光分光光度计，HITACHI。

1.3 BminOBP6的同源建模

使用SignalP5.0网站（https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5.0）预测BminOBP6信号肽序列。通过在线工具SWISS MODEL（https://swissmodel. expasy.org/）对BminOBP6进行同源建模。使用Pro-CHECK对BminOBP6的3D模型进行评估[33]。使用Chimera 1.13.1软件对BminOBP6的3D模型进行必要的颜色修饰。

1.4 BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6）编码序列的扩增

根据构建的BminOBP6的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个螺旋（6）之后的C末端序列，设计特异性引物TOBP6-EF（5′-CGCCAG GAACCGC-3′）和TOBP6-ER（5′- CCCTTA GGCCTTCTTCCAGC-3′）PCR扩增BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6）cDNA，引物序列中下划线分别表示H I和d III酶切位点。

以实验室已有pGEM-T easy/为模板扩增，PCR反应体系（25 μL）：pGEM-T easy/2 μL、TM（TMVersion 2.0）酶12.5 μL、上游引物TOBP6-EF 1 μL、下游引物TOBP6-ER 1 μL、ddH2O 8.5 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃25 s，34个循环；72℃延伸5 min；12℃ ∞。PCR产物使用1%（m/V）琼脂糖凝胶电泳检测，Gel Extraction Kit（Omega）回收目的片段。将回收得到的目的片段连接pGEM-T easy vector后转化Trans5感受态细胞中过夜培养，而后挑取单克隆菌落培养，进行菌液PCR（程序与前一致）验证，将验证正确的样品送样测序。引物合成及序列测定均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.5 TOBP6表达载体的构建

将测序正确的菌液扩大培养后用Plasmid Mini Kit（Omega）提取pGEM-T/质粒。pGEM-T/和表达载体pET-32a（+）用限制性内切酶H I和d III进行双酶切，酶切后经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，胶回收产物使用T4 DNA Ligase加入Ligation Buffer进行连接，然后转化至Trans5感受态细胞中过夜培养。挑取单克隆菌落培养，进行菌液PCR（程序同前一致）验证，将验证正确的菌液送样测序。取测序正确的菌株扩大培养后提取质粒pET-32a/，转化到BL21（DE3）表达菌株中，培养过夜，挑选单克隆菌落培养并进行菌液PCR验证。

1.6 BminOBP6和TOBP6的原核表达与蛋白纯化

将实验室保存的测序正确的pET32a/菌液与验证正确的pET32a/表达菌株扩大培养后，以1﹕100的比例分别加入LB（含Amp 50 mg·mL-1）液体培养基中，在37℃，200 r/min恒温振荡培养箱中培养至OD600达到0.6，加入终浓度0.5 mmol·L-1IPTG继续以37℃，200 r/min诱导表达6 h。诱导完成后以4℃，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，通过SDS-PAGE电泳检测表达情况。用裂解缓冲液（50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol·L-1NaCl，0.5% TritonX-100，2 mg·mL-1溶菌酶）重悬菌体，对重悬菌液进行超声破碎：超声时间4 s、间隔时间5 s，总时间30 min。破碎完毕后以4℃，12 000 r/min离心15 min，分别收集上清液和沉淀，通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达形式。使用Ni-NTA His·Bind Resin纯化树脂纯化含有目的融合蛋白的溶液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒分别测定两目的融合蛋白浓度，并在透析后利用重组肠激酶切除His-Tag获得不含标签的目的蛋白。

1.7 BminOBP6与TOBP6的荧光竞争结合试验

竞争结合试验在F-7000荧光分光光度计上进行：容器为1 cm宽的四通石英比色皿，分光光度计设置狭缝宽度10 nm，激发波长370 nm，发射光谱范围为370—550 nm。使用色谱级甲醇（麦克林，≥99.9%）作为溶剂将荧光探针1-NPN（TCI，＞98.0%）、1-十一醇（TCI，＞99.0%）、(+)-柠檬烯（TCI，＞95.0%）均配置为100 mmol·L-1的母液，用封口膜封存于-20℃，使用时均稀释为1 mmol·L-1的工作液。试验开始前使用Tris-HCl（pH 7.4/5.0）缓冲液将蛋白稀释至2 μmol·L-1的工作浓度。

在比色皿中加入pH 7.4/5.0的2 μmol·L-1蛋白溶液2 mL，随后加入1 mmol·L-1的1-NPN使其终浓度依次为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 μmol·L-1，使其荧光强度达到饱和。每次加入1-NPN后使其反应1 min，再记录荧光强度。每组试验重复3次。比色皿用透析液洗净。采用SigmaPlot 14.0软件对1-NPN浓度与其对应的荧光最大值进行非线性回归拟合分析，并用Scatchard法线性化曲线，计算蛋白与1-NPN的结合常数。

在竞争结合试验中，向比色皿中加入pH 7.4/5.0的2 μmol·L-1蛋白溶液2 mL，随后加入1-NPN使其终浓度为2 μmol·L-1，混匀后向溶液中加入气味配体使其终浓度依次为0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、32、36、40 μmol·L-1，每次加入气味配体后使其反应1 min，再记录荧光强度。每组试验重复3次。假设蛋白活性为100%，且在饱和状态下配体与蛋白按照1﹕1的比例结合，根据公式Ki=IC50/[1+（1-NPN）/K1-NPN]计算解离常数，其中，IC50为荧光强度值下降至初始值50%时加入的气味配体浓度，1-NPN为未结合的1-NPN的浓度，K1-NPN为蛋白/1-NPN的结合常数。

2 结果

2.1 BminOBP6同源建模以及TOBP6序列确认

通过SignalP 5.0结果可知，BminOBP6蛋白的N端存在信号肽部分，由第1—31位氨基酸组成，是分泌型蛋白。将BminOBP6除信号肽的氨基酸序列提交至SWISS MODEL进行同源序列搜索。结果表明，BminOBP6与致倦库蚊（）CquiOBP1（PDB ID：3OGN）具有非常高的序列相似性，为62.6%（图1-A）。同源建模要求目的蛋白的氨基酸序列须与模板蛋白的氨基酸序列相似性高于30%[34-35]。因此，CquiOBP1适合作为BminOBP6同源建模的模板序列。构建好的BminOBP6的3D模型经Pro-CHECK检测评估结果显示（图1-C），模建蛋白91.7%的残基落在最佳区域（红色区域A、B、L），8.3%的残基落入许可区（棕色区域a、b、l、p），没有残基落在勉强许可区（亮黄色区域～a、～b、～l、～p），也没有残基落在不允许区（浅黄色区域）。落在最佳区域的残基为91.7%，大于90%，说明BminOBP6模型属于高质量模型，可靠性高。

BminOBP6具备OBP家族的典型特征：具有6个保守的半胱氨酸残基以及与之对应的二硫键。其最后一个螺旋6在第116号丙氨酸结束，从第117号天冬氨酸到124号脯氨酸形成了由8个氨基酸残基组成的C末端序列（D117—P124），即将被切除的C末端序列（图1-B）。图1-D表示去除C末端序列（D117—P124）的TOBP6。在A116后插入一个终止子密码子并移除之后由8个氨基酸残基（D117—P124）组成的C末端，即TOBP6的氨基酸序列。

A：BminOBP6与模板蛋白CquiOBP1氨基酸序列同源性比对Sequence alignment between BminOBP6 and CquiOBP1；B：BminOBP6三维结构3D structure of BminOBP6；C：BminOBP6 Pro-CHECK质量评估结果the result of Pro-CHECK quality assessment of 3D structure of BminOBP6；D：BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6）三维结构3D structure of BminOBP6 C terminus-truncated mutant (TOBP6)

2.2 TOBP6编码序列的克隆

根据以上推导出的TOBP6氨基酸序列，结合由核苷酸推导的BminOBP6的氨基酸序列（图2），获得编码TOBP6的cDNA序列，即图2中绿色背景的核苷酸序列。以此为基础设计TOBP6上游引物TOBP6-EF和下游引物TOBP6-ER，利用PCR扩增后获得351 bp的特异性条带，该基因片段符合预期结果。连接至pGEM-T easy载体与pET-32a（+）载体后得到的测序结果与理论序列一致（图2）。编码116个氨基酸，分子量为13 464.27 Da，等电点为5.26。

方框内为起始密码子；信号肽序列添加了下划线；圆圈内为6个保守的半胱氨酸；“*”表示终止密码子；绿色背景为TOBP6的cDNA；“→”和“←”分别标记了TOBP6上游和下游引物设计位置The start codon is boxed; Signal peptide part is underlined; Conservative cysteine sites are circled; “*” stands for the stop codon; The green background represents cDNA of TOBP6; “→” and “←” mark positions of the upstream and downstream primers of TOBP6, respectively

2.3 BminOBP6与TOBP6的原核表达与蛋白纯化

含有表达载体pET-32a/、pET-32a/的BL21（DE3）表达菌株分别经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE检测结果显示，表达出了目的融合蛋白并且均大量累积于包涵体中（图3，A4、B4）。在包涵体中表达的蛋白往往没有生物活性，因此对其中的融合蛋白按照已报道的研究进行了变性、复性处理[32]。复性后的目的融合蛋白利用Ni-NTA His·Bind Resin纯

A：1：未经诱导的pET-32a/BminOBP6表达产物Expression products of pET-32a/BminOBP6 without induction；2：经诱导的pET-32a/BminOBP6表达产物Expression products of pET-32a/BminOBP6 with induction；3：BminOBP6上清The supernatant of BminOBP6；4：BminOBP6包涵体The inclusion body of BminOBP6；5：BminOBP6带有His-Tag BminOBP6 with His-Tag；6：BminOBP6去除His-Tag BminOBP6 without His-Tag；M1：宝生物蛋白分子量标准TaKaRa protein molecular weight marker；M2：赛默飞预染蛋白分子量标准Thermo scientific pageruler prestained protein ladder。B：1：未经诱导的pET-32a/TOBP6表达产物Expression products of pET-32a/TOBP6 without induction；2：经诱导的pET-32a/TOBP6表达产物Expression products of pET-32a/TOBP6 with induction；3：TOBP6上清The supernatant of TOBP6；4：TOBP6包涵体The inclusion body of TOBP6；5：TOBP6带有His-Tag TOBP6 with His-Tag；6：TOBP6去除His-Tag TOBP6 without His-Tag；M2：赛默飞预染蛋白分子量标准Thermo scientific pageruler prestained protein ladder

化树脂进行纯化。SDS-PAGE检测结果显示获得了高纯度的目的融合蛋白（图3，A5、B5），其中橙色箭头标示了pET-32a/BminOBP6融合蛋白，绿色箭头标示了pET-32a/TOBP6融合蛋白。蛋白纯化透析后用重组肠激酶切除His-Tag并再次纯化，纯化后蛋白与目的蛋白理论分子量BminOBP6：14 433.38 Da（图3，A6）；TOBP6：13 464.27 Da（图3，B6）相符。采用BCA蛋白浓度测定法测定纯化后BminOBP6的蛋白浓度为0.24 mg·mL-1，TOBP6的蛋白浓度为0.265 mg·mL-1，蛋白纯度与浓度均较高，可用于后续荧光竞争结合试验。

2.4 BminOBP6与TOBP6的荧光竞争结合试验

不同pH条件下，BminOBP6和TOBP6与荧光探针1-NPN的结合曲线及Scatchard方程如图4，A1、B1、C1、D1，并计算得出它们与1-NPN的结合常数Kd：pH 7.4条件下BminOBP6与1-NPN的Kd=（5.60±0.33）μmol·L-1（图4，A1）、TOBP6与1-NPN的Kd=（15.55±1.15）μmol·L-1（图4，C1）；pH 5.0条件下BminOBP6与1-NPN的Kd=（14.68±1.08）μmol·L-1（图4，B1）、TOBP6与1-NPN的Kd=（30.06±0.72）μmol·L-1（图4，D1）。

A：pH 7.4条件下的BminOBP6 BminOBP6 at pH 7.4；B：pH 5.0条件下的BminOBP6 BminOBP6 at pH 5.0；C：pH 7.4条件下的TOBP6 TOBP6 at pH 7.4；D：pH 5.0条件下的TOBP6 TOBP6 at pH 5.0。1：与1-NPN的结合曲线及Scatchard方程Binding curves and Scatchard plots of protein and 1-NPN；2：与1-十一醇的竞争结合曲线Binding curves of protein to 1-undecanol；3：与(+)-柠檬烯的竞争结合曲线Binding curves of protein to (+)-limonene

不同pH条件下，BminOBP6和TOBP6与其配体1-十一醇和(+)-柠檬烯的荧光竞争试验结果表明，在pH为7.4时，BminOBP6与1-十一醇和(+)-柠檬烯均表现出很强的结合能力，ki值分别为（6.89±0.20）和（9.50±0.45）μmol·L-1（图4，A2、A3，表1）。当pH降至5.0时，BminOBP6却丧失了对1-十一醇的结合能力，同时与(+)-柠檬烯的结合能力也大幅减弱，ki值从（9.50±0.45）μmol·L-1升至（31.26±1.06）μmol·L-1（图4，B2、B3，表1）。而不论在何种pH条件下，TOBP6均丧失了对这两种气味配体的结合能力（图4，C2、C3、D2和D3，表1）。

表1 BminOBP6和TOBP6与气味配体的结合特性

表中数值均表示为平均值±标准误；“-”表示不能计算出IC50值

The values in the table are showed as mean±SE; “-” indicates that the IC50value can’t be calculated

3 讨论

3.1 pH对BminOBP6配体结合与释放的影响

OBP在昆虫外周嗅觉系统中的主要功能是结合、运输脂溶性的气味信息素穿过水性触角淋巴液，将其运送至嗅觉神经树突膜表面的OR，进而激活OR[7]。大量的研究已表明，昆虫OBP可以特异性结合其气味信息素[15-17,36-37]。然而，这些OBP是如何释放气味配体激活OR？关于这个问题目前学界主流理论是一种依赖pH变化的气味配体释放机制。这种理论认为昆虫的大部分感器淋巴液的pH接近中性，由于感觉神经元膜上的带负电荷的脂质头基，使得膜附近淋巴液的pH降低约2个pH单位[38-40]。这种pH的改变使得到达感觉神经元膜附近的配体-OBP复合体中的OBP构象发现变化，从而释放配体。目前已有许多实例证明了这一现象，比如，家蚕的气味结合蛋白BmorPBP在中性pH条件下对蚕蛾醇具有很强的结合能力，当pH降低为酸性（pH=5.0）后，BmorPBP对蚕蛾醇亲和性大幅下降[30]。类似的现象也出现在脐橙螟AtraPBP1[25]、多音天蚕蛾AploPBP[23-24]、舞毒蛾LdisPBP[22]、冈比亚按蚊AgamOBP1[26]、埃及伊蚊（）AaegOBP1[27]和致倦库蚊CquiOBP1[28]中。但有些OBP则不遵守这种规则，pH的改变不会影响它们空间结构及其对配体的结合能力。例如，埃及伊蚊AaegOBP22[41]和冈比亚按蚊AgamOBP20[42]。本研究结果显示，BminOBP6在接近中性pH（7.4）条件下对其气味配体1-十一醇和(+)-柠檬烯表现出强结合能力。但在酸性pH（5.0）条件下，BminOBP6完全失去了对1-十一醇的结合能力，同时对(+)-柠檬烯的结合能力也极大地减弱（图4、表1）。这表明BminOBP6释放配体的机制也属于pH诱导的配体释放机制。

3.2 C末端对BminOBP6配体结合与释放的影响

BminOBP6在酸性pH条件为什么能够完成配体的释放？这种配体释放机制在柑橘大实蝇同目昆虫蚊类中研究的最清楚。对AgamOBP1[26]、AaegOBP1[27]和CquiOBP1[28]的研究发现，当配体进入结合腔后，这些OBP的C末端氨基酸残基与OBP其他部位的氨基酸残基会形成pH敏感的分子内氢键（比如在CquiOBP1中，C末端的V125与第1个螺旋的H23和第3个螺旋的Y54形成了4个分子内氢键），这样OBP C末端就被锁定在结合腔的开口，此时的C末端像一个盖子封在OBP结合腔的开口处，当环境pH降低时，那些对pH敏感的分子内氢键被破坏，盖子打开，配体被释放。从同源建模的氨基酸序列及其二级结构比对情况（图1）可以看出，BminOBP6的C末端与CquiOBP1的C末端高度相似，而且在BminOBP6第1个螺旋上同样出现了组氨酸残基H22（在CquiOBP1中是H23），在BminOBP6第3个螺旋上同样出现了酪氨酸残基Y53（在CquiOBP1中是Y54）。因此，BminOBP6很可能具有与CquiOBP1相似的配体释放机制。

由以上这种pH诱导的配体释放机制可以看出，OBP的C末端在其中起到重要作用。本研究为检测BminOBP6的C末端在其与配体分子互作过程中的重要性，构建了切去C末端（D117—P124）的BminOBP6突变体TOBP6。荧光竞争结合试验结果表明，无论哪种pH（7.4或5.0）条件下，TOBP6均完全失去了与其配体的结合能力（图4），这与前人的研究结果不同。在BmorPBP[30]、AtralPBP[25]和HarmPBP1[31]中，无论是中性pH还是酸性pH条件下，C末端的切除并未降低这些OBP与其配体的结合能力。这说明BminOBP6的C末端首先影响的是BminOBP6与其配体的结合过程，或者称为配体的上载过程。然而，目前有关OBP对其气味配体的上载过程的研究鲜有报道。GONG等研究[22,43]认为，昆虫OBP对气味配体的上载过程可能是一个逐步进行的过程，首先气味配体与OBP外部结合位点结合，然后在C末端的帮助下，把气味配体引入OBP的配体结合腔内部。笔者认为这个外部结合位点应该位于OBP的C末端序列以及连接OBP第2和第3个螺旋的环状区。BminOBP6的C末端是否具有结合其气味配体的外部位点？如果有，BminOBP6的C末端是如何把气味配体引入结合腔中的？这些重要问题都需要进一步研究探索。

4 结论

柑橘大实蝇BminOBP6的配体释放机制是一种pH诱导的配体释放机制，推测在此过程中BminOBP6的C末端发挥了重要作用，同时，BminOBP6的C末端在BminOBP6上载其气体配体的过程中也发挥了重要作用。

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Interaction Mechanisms BetweenOdorant-Binding Protein BminOBP6 and Its Ligands

YANG Ling1, TIAN XiaoLi2, GUI LianYou1, WANG FuLian1, ZHANG GuoHui1*

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei

【】To explore the recognition mechanisms of BminOBP6 and its ligands, a C terminus-truncated BminOBP6 (TOBP6) was constructed in this study. Subsequently, the binding affinities of TOBP6 and the wild type protein BminOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene under different pH conditions were determined.【】3D structure of BminOBP6 was built by homology modeling through the online software SWISS MODEL. Based on the established BminOBP6 3D model, the C terminus sequence after sixth-helix of BminOBP6 was determined. This C terminus sequence is the sequence that will be removed from BminOBP6 in the subsequent study. Specific primers were designed to amplify the encoding sequence of BminOBP6 C terminus- truncated mutant TOBP6. Then the recombinant expression vector pET-32a/was constructed. Recombinant expression vectors pET-32a/and pET32a/that has been made before in our lab were transformed intocells BL21 (DE3) to express the TOBP6 and BminOBP6 recombinant proteins, respectively. Fluorescence competitive binding assays were conducted to determine the binding affinities of TOBP6 and BminOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene under different pH (7.4 and 5.0) conditions.【】Amino acid sequence alignments revealed that BminOBP6 shared 62.6% identity withCquiOBP1, and thus the 3D structure of CquiOBP1 was used as the template in the homology modeling of BminOBP6. The 3D structure of BminOBP6 indicated that the C terminus sequence after6 of BminOBP6 is a sequence of 8 amino acid residues (D117-P124). Based on this result, the encoding sequence of TOBP6 was cloned and its recombinant expression vector pET-32a/was built. Recombinant expression vectors pET-32a/and pET32a/were then transformed intocells BL21 (DE3) to express the TOBP6 and BminOBP6 recombinant proteins, respectively. The fluorescence competitive binding results showed that the binding affinity of BminOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene was quite strong at pH 7.4, the Kivalues were 6.89 and 9.50 μmol·L-1, respectively. However, when the pH decreased to 5.0, BminOBP6 completely lost its binding capacity to 1-undecanol and exhibited an obvious decrease in binding to (+)-limonene (the Kivalue increased from 9.50 μmol·L-1to 31.26 μmol·L-1). The binding affinity of TOBP6 to 1-undecanol and (+)-limonene was completely abolished regardless of pH conditions.【】Changes in pH have a significant effect on the ligand binding and release of BminOBP6, and the C terminus of BminOBP6 is crucial for BminOBP6 to bind its ligands.

; odorant-binding protein (OBP); homology modeling; C terminus; prokaryotic expression; fluorescence competitive binding