高通量测序技术在病原体检测中的临床应用进展

卢美伊， 朱志军， 胡开明， 朱 梅

病原体检测对临床诊断与治疗有着重要指导意义。当前临床病原学诊断方法主要有培养法、镜检法、PCR法、免疫学方法（包括荧光法、ELISA法、层析法）和测序技术等，其中以培养法结果阳性为“金标准”。但依赖传统方法仍有许多感染性疾病被漏诊。几乎所有的感染性疾病病原体都含有 DNA 或 RNA 基因组，因此基因组测序成为了病原体检测的一种极佳方法。这种新兴的方法正在改变临床医师诊断感染性疾病的方式，其应用范围涉及广泛的领域，包括微生物组学、抗生素耐药性[1]。测序技术的不断发展大大提高了病原体的检出率，本文主要讨论第二代测序技术在病原体检测方面的应用。

1 测序技术概述

1976年，Sanger等[2-3]报道了一种测定DNA中核苷酸序列的方法，并于1977年测定了噬菌体ØX174的基因组序列，自此病原体检测进入了基因组学时代，这种方法被称为第一代测序技术。但其测序成本高且通量较低，严重影响了这一技术的大规模推广使用。

2005年，新一代测序技术的出现开启了宏基因组学领域。二代测序技术（next-generation sequencing，NGS），也称下一代测序技术，可以同时读取百万到数十亿条核酸序列，理论上能够分析一个临床或环境样本的所有基因序列。在随后的十年中，在可用测序仪器激增和测序成本下降的形势下，NGS已俨然成为检测患者临床样本中的微生物并进行分类的一个有效技术平台[4]。毫无疑问，测序技术已经改变了生物医学研究，越来越多可用的生物体全基因组序列测序是分子生物学实验的一个有价值的工具[5]。到目前为止，许多研究都表明了NGS在临床和公共卫生等领域发挥了巨大作用，比如2019年底暴发的不明原因肺炎疫情便是借助NGS从患者肺泡灌洗液样本中获得了病原体基因组序列，进而通过分离、培养、扩增、对比等方法确定了病原体是结构与SARS冠状病毒极为相似的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）[6]。NGS已成为感染性疾病精准诊断与治疗的关键驱动因素，有助于实现患者的精准与个体化诊疗。

第三代测序技术（third generation sequencing technology）也称单分子实时测序技术，其特点是读长较长，且在进行DNA测序时不需要经过PCR扩增，而是对每一条DNA分子进行单独测序。但就目前实际应用来说，第二代测序技术仍处于主流地位。

2 高通量测序技术在不同感染中病原体检测上的应用

2.1 中枢神经系统感染

中枢神经系统感染的潜在病原体很多，脑脊液（CSF）是临床上诊断中枢神经系统感染的主要样本。CSF在侧脑室脉络丛生成，存在于脑室及蛛网膜下腔中，尽管临床上已有不少诊断性检测技术，但在某些情况下仍然会遗漏一些病原体。早在2008年就有学者报道使用GSL FLX平台，在移植术后患者的CSF中检测出沙粒病毒的病例[7]；2013年，两个独立实验室通过PCR和Sanger测序证实了1例反复发热、头痛、畏光等症状入院的患儿CSF中钩端螺旋体的存在，这是1例罕见的、由神经钩端螺旋体引起的急性发作后持续感染数月的慢性病例[8]；2016年，越南胡志明市牛津大学临床研究中心第一次在尿液中通过深度测序检测到乙脑病毒，随后通过RT-PCR和血清学证实[9]。这些报道证明了宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）能够为临床中枢神经系统感染提供有价值的诊断信息，准确的诊断可以指导合适的靶向抗生素治疗，促进患者的最终康复。许多学者进行了一系列小样本量研究[10-12]，探讨NGS用于中枢神经系统感染的临床价值，结果显示mNGS的诊断灵敏度、特异度、Youden指数都较传统病原学检测高，且根据送检CSF病原体mNGS的客观标准评分，mNGS的阳性准确率随着评分的增加呈升高趋势。虽然mNGS已经显示出诊断临床中枢神经系统感染的能力，但是作为新一代检测手段，它仍然不能取代培养法的必要性，二者的相互补充可进一步提高确诊率。

2.2 呼吸道感染

肺脏是人类呼吸的主要器官，肺炎是一种常见的感染。肺部感染一经诊断通常会使用抗生素进行治疗，这便限制了传统培养法的使用。痰液和支气管肺泡灌洗液（BALF）是肺部感染病原体检测的主要样本，BALF是通过纤维支气管镜对深部肺段（支气管以下的肺段、亚肺段水平）用无菌生理盐水进行反复灌洗、回收获取的肺泡表面衬液样本。因此BALF的病原学检查在呼吸系统疾病（尤其是下呼吸道疾病）的诊断、指导用药、疗效观察及预后判断等方面有着重要的意义。mNGS采用定量检测的方法鉴定病原体[13]，临床研究也证实了其相对于传统方法的临床效用[14-19]。此外，NGS的高通量和大规模测序可同时检测出细菌、真菌、病毒，特别是对于病毒和真菌感染[20]，因此该技术在肺部混合感染上显示出了独特的优势[17]。更广的病原体检测谱还有利于细菌多样性分析，临床上下呼吸道感染通常是微生物群和宿主之间相互作用导致，病原体并不只是一种单一的微生物[21]，一项用mNGS鉴定肺炎患者呼吸道病原体的研究发现，经培养证实感染的个体其呼吸道微生物组的多样性明显较低[22]，这一研究结果提示以微生物群为切入点或许可以为呼吸道感染的诊断和治疗指引方向。

2.3 脓肿

脓肿多由微生物感染引起，表现为人体各器官或系统的局部组织坏死，尽管医学诊疗在不断发展，但仍有很大比例的患者预后不佳，导致功能受限甚至残疾（如骨关节脓肿），生活质量低下。快速、准确地鉴定临床脓肿样本中的病原菌，对临床医师准确选择抗菌药物进行治疗具有重要指导意义。全宏基因组鸟枪法测序（wholemetagenomeshotgun sequencing，WMGS） 在 2018年被用于检测1例布鲁氏菌肝脓肿6年后临床复发的病例，该病例血液和脓肿液培养阴性，但WMGS数据分析表明存在布鲁氏菌[23]。NGS对微生物序列进行无偏倚的检测，可以在一个单一的标准化通用检测中鉴定所有病毒、细菌和真菌，从而为脓肿患者的快速病因学诊断提供了强大的支持[19，24]。长远来看，该技术具有作为细菌培养、PCR或其他目前可用的检测方法诊断脓肿病原菌的补充甚至替代的潜力。

2.4 血流感染

即使患者正在接受抗菌药物治疗，测序也可以检测到病原体的DNA，这提高了mNGS用于诊断培养阴性的血流感染的可能性，如败血症、脓毒血症等的诊断，且mNGS能识别更多的病原体[25-26]，特别是病毒感染，但是mNGS检测到的病毒是致病性的还是携带的，目前尚无统一标准[27]。在疑似血流感染的危重患者临床诊断中，微滴式数字PCR（ddPCR）方法有利于快速检测常见的病原体和抗生素耐药（antimicrobial resistance，AMR）基因，而mNGS检测更适用于经典微生物或分子诊断方法无法检出的血流感染致病病原体[28]。

2.5 眼部感染

自上世纪90年代末以来，病原体PCR等分子诊断技术已经改变了眼部感染的检测方法[29]，NGS的出现亦引起了眼科学界的关注。在一项研究中，学者比较了宏基因组RNA测序（RNA-seq）和PCR检测在诊断眼部感染方面的性能，发现使用RNA-seq可以准确地识别疑似眼部感染患者的房水和玻璃体样本中的常见和罕见病原体，并鉴定菌株[29]；另一项研究发现宏基因组RNA深度测序（metagenomic deep sequencing， MDS）可以准确地检测结膜炎的病原体，并在14%的病例中发现了Vittaforma角膜感染，突显了其精准诊断的潜力[30]。RNA测序是高度无偏性的，因此可以检测到PCR无法识别的病毒，并可以识别非病毒病原体，如肺炎支原体和沙眼球菌，但PCR可以识别RNA-seq检测不到的一些DNA病毒[31]。MDS可以通过生物信息学分析未培养的微生物的DNA/RNA，已用于临床诊断中微生物病原体的鉴定，其中包括眼前段和后段疾病如角膜传染病和眼内炎，甚至用于眼内淋巴瘤[32]。NGS有可能改善眼部感染的诊断，但实际的临床效用还需要更多额外的研究来证实。

2.6 其他感染

除了上述器官或系统，NGS还可以帮助检出感染性心内膜炎患者切除的瓣膜中的病原菌[33]、胰腺炎患者外周血中的巨细胞病毒[34]等。这也提示临床工作者，在诊治疑似感染但传统检测为阴性或者怀疑是某些罕见感染的患者时，均可以考虑采用NGS的方法进行协助诊疗。但NGS目前还存在假阳性的问题，在全面检测样本中微生物的同时并不能区分某些微生物是致病菌还是定植菌。

3 局限性

高通量测序技术推动着精准医疗的发展，但也表现出了一定的局限性，比如mNGS在诊断肺外结核中的作用不及在急性感染性疾病中的作用。Zhang等[35]的研究表明，对于少菌型肺外结核杆菌感染的病例，mNGS检出率较低，为了获得更丰富的结核性病原菌信息，需要更高的测序深度，而超深测序带来的巨大测序成本和分析时间远远超出了许多医院的承受能力。另一方面，NGS技术目前仍缺乏统一的质量控制标准，存在假阳性率及假阴性率偏高、基因数据库不完整、操作流程复杂繁琐、低病原滴度水平样本、检测灵敏度低等问题，因此该技术尚不能作为常规检测手段，只能作为传统微生物检测技术检测病原体的一个重要补充方法。

4 结语

高通量测序技术的出现是测序技术的一大发展，它的进步与改良不断适应着当下基础、临床以及公共卫生等领域的需求。尽管现有的报道和研究大多数为个案报道和小样本量研究，NGS尚存在读长较短、缺乏公认的判读标准、测序结果与治疗关系不明确等不足之处，但随着测序技术及其应用在不断发展，较大规模的比较验证研究会更加完善，更多循证医学证据完善后，高通量测序技术在病原体检测中的临床应用价值将得到进一步证实和提升。