FGF在脊髓发育中的作用机理研究进展

黎 婷，刘宽辉，谢诗慧，刘少华

(1.芜湖职业技术学院食品与生物工程学院/芜湖市生命健康工程技术研究中心，安徽芜湖 241000；2.芜湖市食源性病原微生物检测工程技术研究中心，安徽芜湖 241000)

0 引言

脊髓是中枢神经系统的低端部位，主要与躯体感觉、运动和自主神经系统有关，脊髓发育过程还包括神经嵴形成感觉神经节，以及脊髓与靶器官如器官、肌肉之间的神经支配，因此脊髓的发育在时空上与原始神经组织尾部延伸以适应全身发育是协调一致的.脊柱动物脊髓细胞特异性起源于具有神经和中胚层特征的神经中胚层祖细胞(neuromesoderma progenitors，NMP)，鸡和小鼠的脊髓细胞还起源于与之相邻的外胚层及胚线，这些区域的细胞一部分形成脊髓，一部分形成历经原肠期形成轴旁中胚层[1].脊髓发育包括神经形成开始、腹侧发育、神经嵴迁移都是受到原始神经组织尾部延伸限制的，该复杂协调过程受到多个信号通路调控，尤其是FGF(Fibroblast Growth Factors，成纤维细胞生长因子)信号通路作为决定性调控因子[2].

FGF信号通路在胚胎发育的各个时期和组织中都发挥了调控作用，研究发现通过增强或抑制NMP阶段中FGFs及FGFR实验，FGF在胚胎发育早期作用于胚泡植入、原肠胚形成、神经诱导等过程.该综述主要阐述了FGF信号通路在脊髓发育中，包括神经形成、腹侧发育和神经嵴迁移等这些具有高度神经网络联系的过程中如何进行调控，以及FGF对成年动物脊髓损伤的促脊髓细胞再生和脊髓修复作用，对体外培养的神经干细胞促分化和促发育作用，为再生医学以及FGF的临床应用奠定基础[2].

1 FGF信号通路在脊髓发育中的表达

如同大多数信号通路，FGF通路包括配体、受体、调控因子、胞内换能器和效应器，FGFs家族23种FGF就是配体，受体类型为酪氨酸激酶.FGF信号通路的抑制因子包括SPRY2(sprouty RTK signaling antagonist 2，快速发育生长因子同源蛋白2)、SEF(similar expression to fgf genes)、DUSP6(Recombinant Dual Specificity Phosphatase 6，双特异性磷酸酶6)和ETV(ets variant)家族转录调控因子，在高FGF活性区域和尾部NMP区域mRNAs表达量极高，其表达量对自身表达为负反馈作用[3].但是FGF信号通路中的靶细胞并不是仅仅被FGF激活，对FGF功能分析的难点之一在于鉴定FGF信号通路激活的细胞，因为胞内信号的级联传递并不是FGF信号通路特异性.胞内信号级联传递调控FGF信号通路主要为三个：RAS-MAPK(膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传递途径)、PI3K-AKT(磷脂酰肌醇3-激酶信号传递途径)和PLPCγ信号.在NMPs与其周围被FGF信号通路激活区域中MAPK(mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶)磷酸化水平极高，在这些区域抑制FGFR引起的效应，与抑制MEK(Mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK，丝裂原活化白激酶激酶抑制/MAPK激酶抑制剂)引起的效应几乎一致，显示MAPK是这些区域FGFR主要的下游通路，这种与FGFR的相关性在AKT信号通路并没有发现[4-5].

脊髓发育中FGF信号相关基因的综合分析在鸡和小鼠已经完成.鸡脊髓形成阶段，FGF3、FGF4、FGF8、FGF13和FGF18在NMP尾部及相关区域表达量提高，后期(脊髓延伸和马尾形成)阶段，FGF3、FGF4、FGF13和FGF18只在胚线表达，而FGF8在中胚层入口处广泛表达.FGFR1-3最初在NMP区域表达，后期FGFR1在神经组织，包括NMP区域广泛表达，而FGFR2仅在神经管表达，FGFR3仅在与神经管相邻的体节表达.小鼠中FGF3、FGF4、FGF8、FGF17和FGFR1在NMP区域表达[6-9].

关于FGFs和FGFRs表达调控的研究比较少，目前研究较多的是FGF8，但是FGF8在脊髓NMP区域的转录及渐渐下调以满足脊髓发育与胚胎发育协调是如何进行调控的仍然未知.若干信号通路通过上调或下调影响FGF8的表达，在尾侧WNT/β-Catenin信号通路上调FGF8的表达，Wnt3α(wingless-type MMTV integration site family member 3α，无翅型MMTV整合位点家族成员3α)下调FGF8的表达[10-12].

2 FGF与神经中胚层尾部神经祖细胞及脊髓发育一致性的建立

特异性通过FGF和WNT作用于胚线的上胚层细胞，尾侧NMP区域发育成脊髓，这种特异性作用从原肠胚形成开始，胚线特异性表达基因NKX1.2、CDX1、CDX2、CDX4和HOXB8增加，MAPK信号水平上上调，与FGF调控基因表达有关[13].胚胎实验显示，通过药理抑制因子抑制FGFR阻断FGF信号，鸡胚NKX1.2和HOXB8表达下调；FGF4&FGF8杂合小鼠胚胎NMP区域WNT3α、WNT5α、CYP26α1和T-BRα表达下调；而FGFR1杂合小鼠胚胎NMP区域GBX2和CYP26α1表达下调，显示FGF对NMP细胞关键基因和中胚层细胞的诱导因子(T-BRα)的表达具有重要的调控作用[11,14].NMP区域引起脊髓和中胚层细胞的发生，FGF水平作用于维持这三种类型细胞的平衡，如FGF4&FGF8杂合小鼠胚胎NMP区域中中胚层标记基因TBX6极显著下降；药理学抑制FGFR导致神经管特意基因SOX1显著下降；而过表达FGF8导致NMP分化的失常[15-16].上述结果证实FGF对中胚层和神经胚层发育的必要性，可通过增强NMP区域糖酵解代谢途径中酶的表达引起WNT信号通路的上调，使NMP向神经方向分化.

FGF可促进神经胚层和中胚层分化，FGF信号通路结合WNT信号通路通过特异性基因调控区域，激活并维持神经基因SOX2和SOX3的表达，这种精确调控可使细胞维持在NMP状态，或向中胚层分化，或向神经分化，上述作用被体外小鼠和人干细胞FGF2和WNTs处理实验结果证明[17].NMP中FGF对脊髓特异性同源转录因子HOXB8的表达是必须的，但是当脊髓细胞离开NMP区域，脊髓发育中FGF不是必须的，由脊髓祖细胞分化发育伴随脊髓延伸过程中FGF信号通路下调，而HOXB8高表达可见[18].FGF对NMP的特异性作用机制及对中胚层和神经平衡的维持机制，与其它信号的协同作用相关，从而协调胚胎和脊髓发育的一致性.

3 FGFs与细胞增殖、细胞周期和神经元分化的控制

FGFs对于细胞存活和增殖具有重要的作用，尤其是对神经干细胞和神经祖细胞.脊髓发育过程中，对细胞周期和有丝分裂标记基因NeuroM分析得出两个区域与细胞增殖有关，NeuroM+细胞在体节处开始表达，而受到FGF信号通路调控，尾侧区域(前神经管)与NMP区域都没有NeuroM+细胞.神经管使用FGF处理后会减少NeuroM+细胞的发生，同时也会削弱神经发生的开始[5].

神经祖细胞和干细胞增殖分化产生神经元(N)和神经祖细胞及干细胞(P)有三种模式：自身增殖(PP，产生2个祖细胞或干细胞)、自身取代(PN，产生1个祖细胞和1个神经元)和自身消耗(NN，产生2个神经元)，与不同细胞周期有关.使用FGFs处理后，神经祖细胞增殖只有一种PP模式，显示FGF引起典型的PP短细胞周期，分子生物学实验表明鸡胚神经板中细胞周期调控因子CYCLIND2激活需要FGF信号[17].尽管FGF处理会阻碍神经发生，但是封闭FGF信号并不能驱动有丝分裂和神经发生标记基因NeuroM的表达.

FGF对于脊髓发育的控制与调控神经发生的细胞增殖和神经元分化有关，如在神经发生起始前，FGF2和FGF8调控端脑PP分化模式对称性增殖为神经上皮细胞；在端脑开始神经发生时，神经上皮细胞转变为神经胶质细胞，受FGF10调控继而增殖为神经胶质细胞、有丝分裂后的神经元或神经祖细胞；FGF信号可以防止鸡胚PAX6和IRX3与小鼠PAX6过早表达(PAX6和IRX3是促进神经元分化的转录调控因子)[18].因此，FGF对于细胞增殖、细胞周期和神经元分化是一个复杂的调控网络，使得神经发生前细胞处于增殖，而不是分化状态，但是有许多机制仍待研究.

4 FGF与成年动物脊髓神经元干细胞

在胚胎神经系统发育过程中，少量神经祖细胞和神经干细胞(neural stem cells，NSCs)经过迅速扩增、特化和分化，产生了几百种神经元和神经胶质细胞的亚型.在成年动物生理条件下，神经系统保留了一定的潜能性，能产生数量有限的特化神经细胞亚型[19].成年动物脊髓中具有NSCs特性的是室管膜细胞，但室管膜细胞极少增殖，增殖的子代细胞使体内的室管膜细胞维持一定的数量，而这种增殖机制尚未明了；端脑中具有NSCs特性的是海马的部分结构，如海马齿状回，特异性敲除成年动物齿状回中前体细胞表达的FGF受体(FGFR1、FGFR2和FGFR3)，实验显示FGF对于NSCs的特性维持是必须的，前体细胞中FGFR受体的激活可以促进神经元的形成[20-21].

在正常生理条件下，室管膜细胞增殖数量极为有限，但是在脊髓损伤后，室管膜细胞增殖数量急剧增加，产生大量的星状细胞和少量的少突神经胶质细胞，这种室管膜细胞增殖产生的星状细胞对于脊髓损伤的修复极为重要，否则损伤部位变深，损失大量的神经束[22].

多项研究证实了FGF2对啮齿类脊髓损伤的促功能恢复作用，机制是FGF促进脊髓神经干细胞的增殖，及神经祖细胞表达PAX6、NESTIN和SOX2，从而促进神经元存活、血管发生，减少脊髓损伤的体积；同时减少星形胶质细胞的形成和增生，增加轴突的再生；FGF2通过减少巨噬细胞浸润(可能由于FGF2可促进脊髓损伤后血-脊髓屏障的恢复)和细胞因子水平，还能降低炎症反应.脊髓损伤的临床治疗中，FGF1已经用于颈部脊髓损伤的治疗，FGF1和FGF2水凝胶支架具有显著促进再生功效[23-24].因此脊髓损伤的临床治疗采用的组合治疗方法中，添加使用FGF是一种最有效的促进脊髓结构和功能修复的方式.

5 FGFs促进体外神经发生

哺乳动物神经系统的自我修复能力有限，其中一种补充促修复治疗方法是在损伤位点移植外源细胞.体外细胞实验显示，添加FGF2可显著促进NSCs的增殖和自我更新；促使胚胎干细胞向转化的细胞具有神经元干细胞的特性，具有分化为神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞的潜能，虽然体内并不存在这种具有神经元干细胞特性的细胞；FGF2还用于神经元亚型的特化，胚胎前脑体外培养添加FGF2后，可获得具有脊椎运动神经元特性的胆碱能神经元[25-26].添加FGF的移植实验由于促进细胞有丝分裂，但是不可忽视的是同时有致癌风险，研究显示，为神经诱导添加FGF2或BMP/TGF-β抑制剂培养诱导多能干细胞，可分化为多巴胺能神经元，移植到偏瘫大鼠的损伤部位，FGF2处理的细胞持续增殖，导致肿瘤样生长，与小鼠脊髓损伤移植后的结果相似[27-28].FGFs可促进神经元的产生、增殖和分化，因此在细胞移植治疗中使用FGFs可产生重要作用，但是也有风险.

6 结论

成纤维细胞生长因子(FGF)在细胞迁移和增殖中起着关键作用，通过RNA测序，qRT-PCR，蛋白质印迹和ChIP测定，显示出FGF9在所有FGF中表现出最高的表达，其过表达显著促进了小鼠肾细胞系C57BL/6中的增殖，并增加了JNK和AKT磷酸化水平[29]；此外，RNA-seq分析在FGF9过表达的细胞中鉴定出365个上调基因和276个下调基因，这些差异表达的基因主要分为20个生物学途径，并富集了31个基因[29]；qRT-PCR显示，WNT和NF-κB信号基因的表达及ANXA4表达模式与RNA-seq数据相关，FGF9过表达的细胞与对照细胞相比，β-连环蛋白(一种关键的WNT信号蛋白)积累更多[29].

综上所述，脊髓的胚胎发育过程被FGF信号通路调控，今后可通过建立敲除FGF基因动物模型，研究分析FGF缺失对脊髓发育的影响，进一步阐明FGF在早期神经发生、神经嵴发育和脊髓发育的明确作用.目前FGF信号通路作用的分子机制尚未明了，尤其是对信号通路下游的转录调控，如对MAPK信号通路及FGFR相关信号通路(AKT、PKC等)的详细调控过程，可能是FGF影响ETV家族转录因子的磷酸化和调控染色质修饰基因，如组蛋白脱乙酰基酶1.利用单细胞测序解析等方法序解析胚胎脊髓发育过程，研究分析FGF对胚胎脊髓发育的调控作用，可能用于成年动物脊髓和神经损伤的修复，这对FGF用于神经损伤的临床治疗展现了新的前景.