基于流感疫苗生产用MDCK细胞的安全性评价

2023-04-05康碧静马芳芳马春英王美皓乔自林王家敏

甘肃畜牧兽医 2023年1期

康碧静，马芳芳，马春英，王美皓，乔自林，王家敏*

（1.西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030；3.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃兰州 730010；4.兰州民海生物工程有限公司甘肃省生物工程材料工程研究中心，甘肃兰州 730010；5.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州 730030）

MDCK细胞是Madin和Darby于1958年从一只雌性成年可卡犬肾脏组织中分离得到的一株细胞系[1]。体外培养过程中，MDCK细胞形成自发永生化，研究发现，其对A型和B型流感病毒，柯萨奇病毒B3、B4和B5，呼肠孤病毒，脊髓灰质炎病毒等都具有易感性[2]。因此，MDCK细胞是世界卫生组织推荐的最适宜生产流感疫苗的细胞系之一[3]。目前，生产MDCK细胞基质的流感疫苗主要有：2001年，Solvay公司生产的三价流感疫苗Influvac® TC在荷兰获得审批，但由于生产延误而未上市；Novartis公司使用无血清悬浮培养的细胞系MDCK 33016-PF生产的三价亚单位疫苗Optaflu®在欧盟获得审批[4]；Seqirus公司四价流感疫苗Flucelvax® Tetra于欧盟上市；在美国，Flucelvax Quadrivalent®获得审批上市[5]。相比传统鸡胚基质流感疫苗，细胞基质疫苗具有以下优势：一是生产过程都在生物反应器中进行，全程质量监控，保证了无菌性及产品质量[6]；二是如遇禽流感暴发，可有效避免鸡胚供应受限的影响[7]；三是鸡胚基质在病毒繁殖过程中会产生适应性变异，而细胞基质无此问题[8]；四是灵活性强、成本低，保障了对鸡胚过敏人员的疫苗供应。但在生产过程中发现，MDCK细胞在裸鼠体内注射后会使裸鼠产生肿瘤。如李六金等[9]用包括MDCK细胞等5种传代细胞系对裸鼠进行注射，发现在30代以后，MDCK细胞会使裸鼠形成肿瘤。因此，MDCK细胞在疫苗生产中的安全性存在争议。基于此，对MDCK细胞在流感疫苗生产安全性方面进行评价非常有必要，也是疫苗获得审批的关键。

1 MDCK细胞成瘤性研究

细胞成瘤性是指细胞在接种动物后，接种细胞在动物体内形成（肿）瘤的过程，成瘤性检查是确定细胞形成（肿）瘤的能力。通常对裸鼠或抗胸腺血清（ATS）处理过的新生小鼠进行皮下接种，每只接种107个活细胞，在观察至少4个月后处死，取出肿瘤以及其他器官（心、肝、脾、肺、肾、脑、部分淋巴结）进行组织学检测，判断是否有成瘤性[10]。美国FDA和欧洲药典的检测方式基本相似。1976年，Stiles等[11]在BALB/c裸鼠的肩胛骨进行细胞注射来检验其细胞成瘤性，每周测量裸鼠肩胛骨结节尺寸，当长度超过5 mm时，细胞系归为致瘤细胞系，接种细胞数量为106/只。结果在新生裸鼠上注射时，MDCK细胞使裸鼠生长出0.5～0.6 mm的结节，结节生长在30 d以内，当裸鼠体重到达成年体重时，结节不再生长。而在抑制其免疫能力的成年裸鼠中注射时，细胞数量不变，未能形成结节。从结节中提取出活的MDCK，通过组织学切片检测发现结节不是连续的肿瘤块，而是含有单层柱状上皮细胞的空心球。李六金等[9]对5种动物传代细胞系：MDCK、Vero、F81、BHK21、MA-104进行裸鼠注射来检测其成瘤性。研究发现，F81、Vero和MA-104有肿块形成，但经过组织学检查发现肿块并非肿瘤，因此不是成瘤性细胞系。MDCK细胞在30代以下不具有成瘤性，在30代以上形成的肿块进行组织学切片发现大部分为皮肤组织和肉芽组织，且有坏死，而一部分结节为纤维性肉瘤细胞，异型性明显，将MDCK细胞裂解后接种于裸鼠皮下，无肿块形成，因此，MDCK细胞裂解物没有致瘤性。MDCK细胞的成瘤性主要通过2个参数评估：肿瘤形成能力和肿瘤潜伏期。肿瘤形成能力可以用肿瘤形成剂量的log1050%来表示，简称TPD50；肿瘤潜伏期是指肿瘤出现的时间，可以用2种方法表示，一种是生存曲线，另一种是接种到出现肿瘤的时间。研究发现，MDCK细胞成瘤性有异质性，即不同MDCK细胞系成瘤率和肿瘤形成时间不同，从ATCC不同时间引进3株不同的MDCK细胞系，进行裸鼠注射，细胞株1的TPD50为4.4，细胞株2的TPD50为5.2，细胞株3的TPD50为5.8。肿瘤潜伏期也可反映其异质性，每只裸鼠106的注射条件下，3株细胞系的潜伏时间也不相同。关于这种异质性，有2种解释，一种是在细胞传代过程中，产生了成瘤表型突变；另一种是在不同的细胞批次中含有致瘤表型不同的细胞亚群，每个亚群在体内形成肿瘤的能力不同[12]。Ganguly等[13]使用无胸腺雌性小鼠进行成瘤性试验，每10只为一组，每只107个细胞进行皮下注射，阳性对照为HT-29细胞；后又进行TPD50研究，使用雌性免疫缺陷小鼠进行皮下注射和鼻内注射，皮下注射MDCK细胞浓度分别为101、103、105、107个活细胞/只，阳性对照Hela为107个活细胞/只，而鼻内注射细胞浓度为106个/只，阳性对照Hela和阴性对照Mrc-5也是同样浓度。后又用新生免疫缺陷小鼠、新生仓鼠、新生大鼠检测MDCK细胞致瘤性。结果表明：皮下注射小鼠从第9～40 d肿瘤体积增长，阳性对照肿瘤体积比MDCK细胞组大，组织学观察未见肿瘤转移，TPD50为1.9×104个细胞。通过注射MDCK细胞裂解物及DNA发现除有1只大鼠出现肿瘤外，其余均无肿瘤产生，鼻内注射3株细胞皆无肿瘤产生，因此鼻内给药的途径不具有成瘤性。

2 MDCK细胞致瘤性研究

中国药典中规定，致瘤性是指细胞成分接种动物后，诱导动物细胞本身产生肿瘤[10]，具有致癌风险。为了检测细胞致瘤性，将待测细胞DNA注射进新生裸鼠、仓鼠、免疫缺陷小鼠，经过至少4个月观察，处死后检查是否有肿瘤产生、是否有病灶转移。经研究发现，MDCK细胞不具有致瘤性，也就是说MDCK不会有致癌性。张德礼等[14]将4株MDCK细胞进行完整细胞注射和裂解物注射，4株MDCK细胞系注射完整细胞裸鼠有肿瘤生成，而裂解物均未产生肿瘤，此结果与Ganguly等[13]研究结果一致，其中一只成瘤的大鼠经过组织学检查发现肿瘤为良性。因此，MDCK完整细胞虽然具有成瘤性，但其裂解物及DNA没有致瘤性或致癌性。根据世界卫生组织对细胞基质的要求，每剂量疫苗DNA残留量不得高于10 ng，另有研究证明如果在体内有1 ng细胞的DNA，而基因组中有100个激活的致癌基因拷贝，则发生转化的概率为1/109[15]，哺乳平均基因为3 000～10 000个碱基对，假设该哺乳动物基因组中DNA残留量为10 ng，则该动物基因组中致癌基因为0.000 01～0.000 1 ng，目前没有证据表明致癌基因及其他DNA在此数量级水平有生物活性[16]。

3 应对策略

MDCK 33016-PF细胞可生产三价流感疫苗Optaflu®，但由于MDCK细胞的成瘤性，为了保证生物制品的安全性，必须要求疫苗中不含活细胞，保证细胞裂解物不致癌，保证细胞底物不含致癌病毒或致癌DNA。因此，有一系列后续纯化工艺来确保其安全性。为了过滤细胞，首先进行一个初始的离心步骤可过滤99%的细胞，其次进行一次0.45 μm的过滤，再进行两次0.2 μm的过滤，最后再经过0.2 μm的无菌过滤，MDCK细胞直径约15 μm，而过滤孔径很容易去除大量MDCK细胞，过滤的细胞依次大于9.2 log10、8.8 log10、8.8 log10、8.8 log10数量级；又经过化学过滤，β-丙内酯、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）以及聚山梨酯80（Tween 80）都可使MDCK细胞失活，通常可使6 log10数量级细胞失活。过滤纯化后，每剂疫苗存在活细胞的概率为1/1034，而DNA的残存量规定每剂量不超过10 ng。为了去除DNA，纯化步骤包括硫酸纤维素离子交换层析和随后的CTAB沉淀步骤，其中β-丙内酯可与DNA发生反应，使DNA断裂，降低DNA聚合酶活性。这些生产步骤都能有效去除DNA残留，使99.99%以上的残余DNA长度低于200 bp，远远小于编码致癌蛋白1 000 bp的长度，且凝胶电泳未检验出大于200 bp的DNA片段[17]。因此，通过对MDCK致瘤性的研究和生产工艺的质量控制，可保证疫苗生产的安全性。

理论上选用低成瘤甚至无成瘤的细胞系可大大降低疫苗成瘤性风险，Liu等[18]通过有限稀释法克隆出MDCK 9B9-1E4，通过对其成瘤性、致瘤性进行研究发现，大多数成年裸鼠的结节在6个月后消失，有一只裸鼠虽产生肿瘤，但通过组织学和免疫组化验证发现肿瘤自发形成，并非注射形成。将MDCK细胞裂解物和细胞DNA进行注射，虽然有动物产生肿瘤，但经检测发现并非注射MDCK细胞裂解物及细胞DNA产生，系自发形成，从而证实MDCK 9B9-1E4是一株无成瘤细胞系，为了验证其成瘤特性，后又插入H-ras基因和MMP14基因，这2种基因都可激活小鼠c-myc基因导致肿瘤形成，结果发现转染的MDCK-Myc-Ras和MDCK-Src-MMP14在注射部位形成肿瘤，而MDCK 9B9-1E4未形成肿瘤[19]。因此，经过疫苗生产过程中物理过滤及化学纯化，在每剂流感疫苗中MDCK细胞存在的概率为1/1034，概率极低，所以MDCK细胞基质的流感疫苗可认为是安全的。