胞外囊泡在银屑病中的研究进展

陆子轩 吴建华

海军军医大学附属长海医院皮肤科，上海，200433

银屑病是一种多基因遗传背景下免疫介导的慢性复发性炎症性皮肤病，全球患病率约为2%[1]。银屑病的特征主要是以多种免疫细胞浸润为基础的持续炎症引起的角质形成细胞的过度增殖和分化异常，主要表现为局限或泛发的鳞屑性红色斑块，可伴关节炎等系统性损害。在遗传背景基础上多因素诱发的先天和获得性皮肤免疫反应紊乱导致了银屑病炎症的发展和持续。胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是可由几乎所有细胞释放的一类脂质双层包裹的颗粒，可作为载体向邻近或远处目标细胞运输生物活性物质,通过这种细胞间通讯方式调控广泛的生理或病理反应[2]。近年的研究表明[3，4]，EVs穿梭在多种类型的细胞中，参与了银屑病、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、大疱性类天疱疮等慢性炎症性皮肤病和自身免疫性疾病的发病过程。本文介绍了EVs的生物学特性及其在银屑病发病机制中的研究进展，并探讨EVs在银屑病诊断与治疗中的价值。

1 EVs的来源及生物学特性

根据大小和生成途径不同，EVs大致可分为两大类：ectosomes和exosomes(外泌体)。前者由质膜直接向外出芽而形成，包括直径约50 nm～1 um的微泡(microvesicles)、微粒(microparticles)和大囊泡(large vesicles)；而后者经细胞内吞途径形成，由含有多个腔内囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)的多胞体(multivesicular bodies，MVB)与质膜融合释放，直径约40～160 nm(平均约100 nm)，CD63、CD81和CD9等跨膜蛋白是其重要的表面标志物[2]。EVs的内部或表面可携带蛋白质、DNA、RNA、脂类以及代谢物等多种细胞成分，通过向受体细胞传递特定内容物发挥重要的物质交换和胞间通信作用，参与多种免疫反应和疾病的发展。其中，外泌体因其独特的生成途径受到更多关注。外泌体可存在于血液、尿液等诸多体液中，其含有的miRNA和蛋白质等功能性内容物可能作为诊断性生物标记物。同时，外泌体作为潜在的治疗靶点或作为输送药物的有效载体，具备很有前景的治疗潜力[5]。然而由于目前的技术尚不能分离出完全纯化的外泌体，因此有人指出现阶段应将很多文献中的“外泌体”视为包含外泌体和微泡等小胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEVs)的混合物[6]。

2 EVs在银屑病发病机制中的作用

现有研究认为[1，7]，损伤的角质形成细胞分泌的LL37、β-防御素(β-defensins)等抗菌肽可被树突状细胞(DCs)识别，这在银屑病的初始阶段起着重要作用。激活的髓系树突状细胞(mDCs)释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-12(IL-12)和IL-23，促进辅助性T淋巴细胞(Th)1和Th17亚群分化和增殖，分泌干扰素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-21和IL-22刺激表皮角质形成细胞的增殖，推动了银屑病炎症的维持阶段。其中TNF-α及IL-23/IL-17轴在银屑病发病机制中有中心地位。

2.1 角质形成细胞来源EVs 为研究银屑病中角质形成细胞外泌体对中性粒细胞的影响，Jiang团队[8]用银屑病细胞因子鸡尾酒(IL-17A、IL-22和TNF-α)作用于角质形成细胞，发现其释放的外泌体被中性粒细胞摄取后可促进中性粒细胞胞外诱捕网形成和IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子的表达，且咪喹莫特(imiquimod，IMQ)诱导的银屑病小鼠的角质形成细胞外泌体可促进小鼠皮肤中性粒细胞浸润和角质形成细胞增殖。这些效应可能是通过NF-κB和p38MAPK途径实现的。在此基础上，该团队进一步研究了角质形成细胞sEVs对T细胞的作用，发现经上述细胞因子鸡尾酒处理的角质形成细胞的sEVs促进了Th1/Th17极化[9]。这可能是由于sEVs中显著增多的miR-381-3p通过抑制CD4+T细胞中UBR5和Foxo1两种靶基因的表达减弱了二者对Th1和Th17的负性调控。此外，银屑病患者外周血CD4+T细胞中miR-381-3p的表达亦显著上调，且其含量与银屑病面积和严重程度指数(PASI)评分呈正相关，提示miR-381-3p可能作为判断银屑病病情的生物标志物。这些工作表明通过阻断银屑病角质形成细胞的EVs或其功能性内容物对中性粒细胞、T细胞等靶细胞的作用是银屑病潜在的治疗策略。

还有研究者[10]发现经重组人IL-17A处理的HaCaT细胞EVs中β-defensins 2、中性粒细胞趋化因子(CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL6和CXCL8)表达增加，而使用IL-17A抗体Secukinumab预处理可完全消除这些变化。经处理的EVs被其他HaCaT细胞摄取后可诱导受体细胞中内源性β-defensins 2的过度表达，这主要是由于IL-17A随EVs转移到受体细胞所致。表明角质形成细胞EVs可放大由IL-17A诱导的角质形成细胞中的促炎级联反应，这一机制可能在银屑病皮损周围慢性炎症状态的放大中发挥作用。

2.2 免疫细胞来源EVs 来源于肥大细胞和中性粒细胞等免疫细胞的EVs在银屑病的发病机制中同样具有重要作用。比如有研究[11]发现，银屑病患者肥大细胞在IFN-α诱导下通过外泌体将一种胞浆型磷脂酶A2-PLA2G4D转移到胞外，激活脂质特异的CD1a反应性T细胞，促进IL-22和IL-17A生成，抑制PLA2G4D或阻断CD1a可能对银屑病具有治疗效果。Shao等[12]证实泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)患者中性粒细胞通过外泌体激活角质形成细胞中GPP相关炎性基因，促进细胞因子(IL-1β、IL-18、IL-36G和TNF-α)与趋化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL8和CCL20)的高表达，导致中性粒细胞的迁移和自身炎症循环的加剧。这可能是由于GPP患者中性粒细胞外泌体中人类嗅素蛋白4(olfactomedin 4，OLFM4)、脂质运载蛋白2(lipocalin 2，Lcn2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和S100A8等功能性抗菌蛋白和酶差异性表达增多，通过激活MAPK和NF-κB通路在角质形成细胞中发挥效应。其中，OLFM4可上调中性粒细胞趋化因子表达且其水平与GPP的严重程度呈正相关，可作为判断GPP患者病情严重程度和预后的标志。这一研究完善了银屑病中角质形成细胞和中性粒细胞之间通过外泌体相互作用并产生不同效应的可能机制，同时表明EVs不仅在适应性免疫反应主导的寻常型银屑病中意义重大，在先天免疫系统主导的GPP中同样有重要作用。

2.3 微生物来源EVs 多种证据支持皮肤或肠道微生物的失调参与银屑病的发病机制。基于重度银屑病患者和健康对照组血清来源的EVs 16S rDNA的测序分析表明，其来源的细菌群落有明显差异，中重度银屑病患者中芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等菌群较多[13]。血清EVs可作为评估银屑病患者微生物群变化的指标，这些异常的微生物群可能通过血清EVs参与了银屑病的发病。

表皮葡萄球菌是重要的皮肤共生菌，其在银屑病患者的受损皮肤上明显减少。表皮葡萄球菌共生株(ATCC12228)和临床分离株(983)来源的EVs对HaCaT细胞和IMQ诱导的银屑病小鼠模型的影响有明显差异[14]。相较983EVs，ATCC12228EVs对共培养的HaCaT细胞细胞因子的表达无明显影响，而显著降低小鼠皮损中中性粒细胞的浸润和炎性细胞因子的表达，并增加IL-36受体拮抗剂(IL-36Ra)的水平。表明ATCC12228的缺失可能在银屑病的发展中起到了作用，ATCC12228EVs在银屑病中具有潜在抗炎作用，这一效应可能与其含有的丰富酶类细菌产物有关。

3 EVs作为银屑病的诊断性生物标志物

目前银屑病严重程度判定缺乏有效的实验室指标。EVs在各种体液中广泛分布，其表面和内部有多种微小RNA、功能性蛋白、mRNA以及长链非编码RNA等活性物质，且因受到脂质双层保护较游离状态性质更稳定，可能成为评判银屑病严重程度和治疗效果的重要指标。

3.1 微小RNA(microRNA，miRNA) miRNAs是一种介导转录后调控的短单链非编码RNA。最近发现[15]，银屑病患者血清EVs中miR-11400上调、miR-501-3p下调最为显著。同时，miR-199a-3p在银屑病患者中的表达水平显著高于健康对照和玫瑰糠疹患者，且与PASI评分和受累体表面积(BSA)均呈正相关。表明血清EVs中miR-199a-3p不仅有助于鉴别银屑病和玫瑰糠疹，还可以反映银屑病的严重程度。

银屑病性关节炎(psoriatic arthritis，PsA)在银屑病患者中发生率较高，易漏诊和误诊，目前尚无PsA诊断的特异性血清学标志物。有研究[16]发现，外泌体参与PsA的发病，PsA患者外周血外泌体能促进破骨细胞的分化和成熟，加重关节炎症和骨侵蚀。有19个血浆来源的EV miRNAs被证实在伴或不伴PsA的斑块型银屑病患者中存在显著差异[17]，其中let-7b-5p和miR-30e-5p在前者中的表达水平明显低于后者。这项研究的一个不足之处是未设置健康对照组进行更有说服力的比对。另一项类似的研究[18]使用RNA测序证实了PsA和寻常型银屑病患者以及健康对照者血清EVs中miRNAs的含量存在明显富集差异。如在PsA组血清EVs中miR-10b-5p、miR-10a-5p和miR-34a-5p等miRNA的水平显著低于对照组；且相较于寻常型银屑病患者，PsA患者血清EVs中的QXBT12、miR-671-3p和miR-342-3p显著减少，而miR-33a-5p和miR-338-5p明显增多。这两项研究在结果上的差异可能由多种原因导致，如样本量较小、群体差异以及EVs提纯方法不同等。但仍然提示PsA患者血清EVs中特征性改变的miRNAs可能反映了PsA关节损伤的病理过程，是PsA早期诊断和预后判断的潜在生物标记物。

3.2 蛋白质类 有研究[19]发现，不论是否经过甲氨蝶呤、IL-17抗体等全身治疗，中、重度银屑病患者血浆中IL-17A外泌体水平均显著高于轻度银屑病患者。表明血浆中IL-17A外泌体水平可能是评估银屑病患者系统治疗反应的稳定的生物标志物。但受限于样本量，未发现血浆中IL-17A外泌体与银屑病的严重程度之间的线性相关关系。

4 EVs在银屑病治疗中的研究进展

近年来，虽然针对TNF-α和白细胞介素的银屑病生物靶向治疗取得了一定的成就，但银屑病的根治仍处困境，因此要不断探索新的治疗方法或药物。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。已有一些动物研究和临床案例报道显示MSCs对银屑病有较好治疗效果[20]。MSCs外泌体(MSCs-exo)被认为是MSCs与靶细胞之间相互作用的主要方式，MSCs-exo在调节Th17/调节性T细胞(Treg)平衡方面与MSCs作用相似，可抑制Th17分化，促进Treg增殖[21]。此外，外泌体作为运输各种治疗剂的载体在银屑病中的治疗作用同样值得探索。

4.1 MSCs-exo在银屑病治疗中的研究进展 MSCs-exo的应用途径不同可能涉及不同的作用机制，产生不同的效果。局部外用(无论是在水溶液中还是在水包油乳剂中)人胚胎干细胞来源的MSCs-exo可渗透进小鼠皮肤角质层，降低IL-17、IL-23以及末端补体复合体C5b-9的水平[22]，这可能由于MSCs-exo通过抑制补体的激活减少了中性粒细胞在角质层的聚集和IL-17的释放。脐带血单个核细胞富含MSCs，其来源的sEV处理的3D银屑病皮肤模型中炎性因子(IL-6、IL-8、CXCL10和COX-2)及S100A7和β-defensins 2的表达显著减少，局部外用sEV水凝胶制剂可减弱IMQ诱导的小鼠角质形成细胞的过度增殖，并增加皮肤中Treg的数量[23]。这两项局部应用MSCs-exo的动物实验中均未见明显的肉眼皮损改善，仅在病理和细胞因子水平显示出一定抗炎作用。不同的是，皮下注射人脐带来源的MSCs-exo可明显改善IMQ诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症，且皮损中STAT3/p-STAT3、IL-17、IL-23和CCL20水平降低[24]。表明人脐带来源的MSCs-exo可能通过抑制STAT3/p-STAT3通路，下调IL-23/IL-17轴关键炎症因子的表达。

4.2 外泌体作为运输载体在银屑病治疗中的研究进展 外泌体可被设计用来输送短干扰RNA、反义寡核苷酸、化疗药物和免疫调节剂等不同的治疗剂。细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)可负性调控JAK/STAT信号通路。通过重组腺病毒感染DCs可获取含SOCS1的外泌体，将获得的外泌体皮下注射作用于IMQ诱导的银屑病小鼠可显著改善其皮损，降低外周血IL-17A和IL-23的表达[25]，这可能与SOCS1外泌体抑制Th17/IL-17轴有关。程序性死亡分子1(programmed cell death 1，PD-1)及其配体程序性死亡分子配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是重要的负性免疫调节因子。Xu等[26]利用病毒感染小鼠骨髓来源的MSCs构建了含PD-L1的小胞外囊泡(MSC-sEVs-PD-L1)。在体外MSC-sEVs-PD-L1通过改变激活的T细胞、DCs和巨噬细胞等免疫细胞的表型使其处于免疫抑制状态，并减少IFN-γ、TNF-α和IL-2等炎性细胞因子的产生，静脉注射MSC-sEVs-PD-L1可使银屑病小鼠表皮厚度明显减小、皮损改善，而上述改变可被PD-L1抗体所消除，表明MSC-sEVs-PD-L1可能对银屑病有治疗潜力。

5 小结

综上所述，在银屑病中，外泌体等EVs可由角质形成细胞、免疫细胞等多种细胞及微生物产生，作为胞间通讯的重要载体介导靶细胞产生多种效应，参与银屑病的不同发病机制。其携带miRNA(如miR-381-3p、miR-199a-3p)和蛋白质(如OLFM4、IL-17A)等多种活性物质且具备优良的稳定性，可作为银屑病早期诊断、疗效及预后评价的生物标志物。EVs不仅是银屑病潜在的治疗靶点，而且经设计的EVs可作为载体运输不同的治疗剂(如SOCS1、PD-L1)。同时，MSCs-exo克服了细胞治疗的局限性，是一种有前景的银屑病无细胞治疗新途径。然而，还有许多问题亟待解决。首先，通过超速离心等常用的分离方法，尚不能完全区分外泌体和其他胞外囊泡，尤其是功能性微泡；其次，当前有关外泌体的研究局限于体外和动物，基于外泌体的临床疗法在人体中的安全性和有效性有待证实。因此，不仅要不断开发新的分离和检测技术，还需要开展更多的基础研究揭示外泌体的生成、转导和在银屑病中的作用机制，以及更大规模和更长周期的动物实验来评估其疗效和长期不良反应，以期尽快实现其向临床的转化。总之，目前对EVs在银屑病领域的研究还只是冰山一角，还有巨大的潜能有待挖掘。