功能性益生菌的筛选及在食品中应用进展

汪洪涛，孙梓秋

（江苏经贸职业技术学院健康学院，江苏南京 211168）

近年来，随着社会的不断发展，消费者提高了对健康方面的意识，更加重视食品营养相关的问题。而益生菌是指通过摄入足够的数量，为宿主生物体提供一种或多种特定的并具有临床证明的功能益处的“活的微生物”的总称[1]，因其具有抵抗病原菌的入侵维持肠道菌群平衡[2]、可以通过调节宿主特异性和非特异性免疫来增强机体的先天免疫能力[3]、对经典抗性细菌和其他新兴抗性微生物具有显著的抑制作用[4]、可以合成人体必需的B族维生素、多种氨基酸和矿物质以此来改善宿主的健康状况[5]、抑制癌细胞的增殖速度以及降低肿瘤和一些过敏等慢性疾病的发病率[6]等生理功能，故含有益生菌的食品在市场上变得流行起来并受到广泛的关注，使功能益生菌的研究成为焦点。本文旨在通过对不同益生菌的筛选途径及在食品中的开发应用方面进行探究，为益生菌进一步的开发研究提供理论借鉴。

1 益生菌的种类

益生菌的种类繁多，分布广泛。目前益生菌大致被分为乳杆菌类（乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌等）、双歧杆菌类（两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌等）、芽孢杆菌类（巨大芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等）、链球菌类（嗜热链球菌、乳链球菌、肺炎链球菌等）和其他类（酵母菌、大肠杆菌等）五种类型[7]。目前最常用的益生菌主要有酵母菌、乳杆菌、双歧杆菌等。

2 益生菌的筛选标准及筛选途径

2.1 益生菌的筛选标准

筛选益生菌需要满足以下三个核心特征：安全无害并对机体有健康的功效、保持活菌的状态、有足够的数量。同时根据《食品益生菌评价指南》，通过体外试验筛选益生菌时耐酸性和胆汁稳定性以及肠道黏膜黏附特性也是益生菌筛选的标准之一[8]。传统上，食品中益生菌的质量控制仅依赖于检测，以确保在产品的整个保质期中存在足够数量的活菌。益生菌菌株也必须保留其最本质的功能特征，这些特征包括在胃和小肠内生存的能力、耐受酸性条件能力、在胆汁存在下生存和生长的能力等。同时粘连特性是评价肠道屏障作用的重要质量控制方法，包括粘连与缩短腹泻持续时间、免疫原效应、竞争性排斥等[9]。

2.2 功能性益生菌的筛选途径

2.2.1 降血脂血糖的益生菌筛选

目前由于人们饮食不合理而导致摄入的能量及饱和脂肪酸和反式脂肪酸过多，从而引发一系列的高血脂、动脉粥样硬化等心血管疾病。国内外的一些研究表明特定的益生菌可通过改善宿主代谢降低心血管疾病发生风险[10]。GAO Y R等[11]利用体外降胆固醇等功能评价试验，从中国传统的发酵黄瓜中筛选出具有降低胆固醇和甘油三酯功能的嗜酸乳杆菌L2-16和粪肠球菌L2-73。这两种菌株未来可在发酵蔬菜、牛奶、肉类等发酵食品以及具有降血脂、降肝脂功能的益生菌制剂生产中进行应用。WON S M等[12]从韩国11种泡菜中分离得到的清酒乳杆菌ADM14能抑制3T3-L1细胞的脂质积累，该菌具有益生菌潜力和替代治疗补充剂的潜力，且具有较高的安全性和生存能力。WANG J B等[13]以国内外特色食源性物质为乳酸菌来源，通过测定菌株α-葡萄糖苷酶抑制能力，筛选出的鼠李糖乳杆菌LB1lac10具有降低血糖的功效，同时确定了该菌所产胞外多糖EPS1-1也有可能作为天然α-糖苷酶抑制剂来调节血糖浓度，该菌及其胞外多糖未来在降血糖食品的开发方面具有一定的潜力。

2.2.2 降血压的益生菌筛选

现代人的一些不好生活习惯如久坐不动、长期饮酒、吸烟、焦虑等都会是导致高血压的因素。关于人体研究的荟萃分析结果表明，补充益生菌可以降低血压[14]。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）在血压调节过程中具有重要作用，某些益生菌比如乳酸杆菌和双歧杆菌可以通过血管紧张素转移酶（angiotensin converting enzyme，ACE）控制RAS从而具有降压作用[15]。KORHONREN H[16]研究表明，从乳蛋白中提取的具有生理活性的多肽具有减少轻度高血压的功效。发酵乳制品如酸奶和奶酪中含有多种天然形成的生物活性肽，肽在母体蛋白质分子的序列中是不活跃的，但可以用蛋白水解发酵剂发酵牛奶或蛋白水解酶水解而释放出ACE抑制肽，进而产生降低血压的作用。TSAI J S等[17]用5种乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌）在42 ℃下发酵豆乳30 h，发酵5 h后加入蛋白酶。发酵后从豆浆中分离出乳清。然后用乳清（肽质量浓度10 mg/mL）作为饮料给予自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）8周，口服8周后SHR大鼠收缩压降至19.0 mmHg。上述有关结果表明，未来利用乳酸菌在开发一些具有降血压的蛋白制品方面具有一定的潜力，可以进一步的开发利用。

2.2.3 增强机体免疫力的益生菌筛选

益生菌在进入人体后可以黏附在肠道内，通过改善肠黏膜的保护功能，促进特异性和非特异性抗体的形成，提高肠道黏膜的抵抗力和改善免疫系统[18]。BU Y S等[19]研究发现，植物乳杆菌Q7、F3-2和YRL45均具有益生潜能，对胃肠道环境和肠道定植具有耐受性，在肠道屏障中表现出不同程度的抗炎活性和紧密连接功能，减轻炎症反应，有利于保护肠屏障。结果表明，菌株Q7、F3-2和YRL45具有作为新型益生菌菌株在有利于肠道健康的产品开发方面的潜力。WANG W W等[20]以清酒乳杆菌作为益生菌P，对从粪便中分离的14株双歧杆菌进行了抑菌试验，选择抑制率为73.75%的双歧杆菌B10作为益生菌B。此外，与葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）组相比，清酒乳杆菌-双歧杆菌B10组合物（PB）显著降低DSS诱导的结肠炎小鼠结肠的表达。目前我国居民应不良的生活习惯和饮食习惯导致居民的抵抗力和免疫力大大下降，因此该研究筛选出的清酒乳杆菌-双歧杆菌B10组合具有通过免疫调节和肠道微生物群调节缓解肠病，未来可以利用其开发一些益生菌制剂或相关益生菌食品提高机体的免疫力。

2.2.4 抑制病原菌的益生菌筛选

益生菌重要功能性指标之一就是可以抑制病原菌生长，其可通过产生多肽类抗菌物质、有机酸等抑制胺、吲哚等有害物质的产生，从而具有抑制病原菌、缓解炎症的功效[21]。ANA P等[22]利用从不同食品中分离的280株乳酸菌进行了对几种食源性致病菌的抑菌活性筛选，结果显示分离出的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CFF4能够产生细菌素且在模拟胃肠道传代后粘附于Caco-2细胞，也能在体外抑制食源性致病菌生长。因其不产生毒力因子和抗生素耐药性，故是一种潜在的益生菌，可用于食品工业。胡鹏钰等[23]通过耐酸耐胆盐能力测试，从母乳中筛选出7株菌株，并对其进行抗生素耐药性和致病菌抑制能力的测定。结果显示，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）M53和短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）grx05对3株革兰氏阳性菌和1株革兰氏阴性菌有明显的抑制效果，且有较高的安全性，有希望作为具有益生特性的菌株应用到发酵食品或益生菌制剂开发。

潘浩宇等[24]以琼脂扩散法作为抑制病原菌的主要筛选方法，选取了不同的粪肠球菌、魏斯氏菌等共计62株菌株进行试验，结果发现，筛选出的发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌不仅具有很强的耐酸性，同时在抑菌性上也表现出良好的性状，显示出良好的益生菌特性，可以进一步开发应用。朱晶婷[25]对于副溶血性拮抗菌的筛选中，采用点种法从凡纳滨对虾中分离出119株菌株，14株表现出拮抗作用，再通过纸片法进行复筛，得到对副溶血性弧菌具有较好抑制作用的益生菌D9。可以进一步利用该菌株控制水产养殖行业副溶血弧菌的爆发和水产品食源性疾病的预防。赵梓雯[26]对抗鼠伤寒沙门氏菌的益生菌筛选中，通过细胞侵染实验以及荧光定量研究对鼠伤寒沙门氏菌的致病能力，结果筛选出短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）YH68具有较强的抑制作用，有成为抗生素类替代品的潜力。

2.2.5 抗氧化的益生菌筛选

当体内的氧化应激水平超过身体的抗氧化系统去除活性氧的能力时，就会发生氧化应激。益生菌能有效调节人体内氧化应激的平衡并且具有抗氧化性，但其克服氧化应激的能力和它们所具有的抗氧化机制的水平和类型有关[27]。在ATHINA A等[28]测定了来自不同食品中的乳杆菌菌株在低温（8 ℃）和暴露于20%～90%浓度的氧气水平下的抗氧化性能。结果显示，在8 ℃和20%浓度氧的条件下，乳杆菌菌株生长良好，但大多数菌株不能在高达50%和90%浓度氧的条件下生长。所有菌株的细胞游离提取物均具有一定程度的羟基自由基清除能力和还原能力。陈君[29]从不同来源的食品中分离纯化出26株菌进行清除自由基试验，对初筛出的抗氧化性较高的4株乳酸菌和6株酵母菌进行复筛后，发现其中乳酸菌L1、L2和酵母菌Y3、Y5具有很强的清除超氧自由基、还原能力、抗脂质过氧化能力并在一定程度上延缓小鼠衰老。

2.2.6 促进营养物质消化吸收的益生菌筛选

平衡的微生物群是健康肠道不可或缺的组成部分。肠道中益生菌产生的一些酶和酸性等物质可以有效的帮助消化食物残渣，促进营养物质的再次吸收利用[30]。DOWARAH R等[31]将36头断奶的健康猪仔（28日龄）随机分为3组，分别饲喂不含益生菌、含嗜酸乳杆菌和乳酸片球菌为基础的食物。试验结束时，选取6头体质量接近的仔猪进行消化试验，测定养分消化率。结果显示，与对照组和嗜酸乳杆菌组相比，饲喂乳酸片球菌的猪仔对粗蛋白和粗脂肪的表观消化率更好，乳酸片球菌饲喂组红细胞中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性较高。研究结果表明，筛选出的乳酸片球菌具有潜在的体外益生特性，具有更高的营养物质消化率、血液生化和抗氧化状态，具有潜在的益生候选能力。

2.2.7 其他功能性益生菌的筛选

益生菌不仅具有强大的肠道功能，还具有其他对人体十分有益的功能。RICHARD N F等[32]通过VSL#3（8种不同益生菌种类的混合物），在回盲结肠切除术和再吻合术后30 d内，随机给克罗恩病患者1包VSL#3（9 000亿活菌，包括1株嗜热链球菌、3株双歧杆菌和4株乳酸杆菌）或匹配安慰剂。结果显示与安慰剂相比，接受VSL#3的患者在第90天黏膜炎性细胞因子水平降低，在接受早期VSL#3的患者中具有较低的黏膜水平的炎症细胞因子和较低的复发率。因此该试验筛选出的益生菌具有降低炎症的作用。LIANG C等[33]通过高通量测序对正常体质量和肥胖儿童肠道菌群进行调查，在体外和体内筛选出具有潜在抗肥胖特性的菌株。结果发现，所得菌株表现出明显的抗肥胖作用，可以进一步用于具有益生菌的减肥产品的开发。BHAGYA H M等[34]从人类初乳中分离的64株乳酸菌被用于进一步筛选细胞外叶酸的生产，结果显示，4株植物乳杆菌CKR5、CKR8、CKR12和CKR28均能生产叶酸且均具有广谱抗菌活性，其中CKR8和CKR12还具有抗真菌活性，因此四株植物乳杆菌菌株均具有良好的益生潜力。

3 功能性益生菌在食品中的开发应用

因益生菌具有改善肠道健康、增强免疫系统、可以合成和提高营养物质的吸收利用率等功能，使得益生菌在食品中的应用成为热门的研发方向。

3.1 含益生菌的乳制品

现在市场上含益生菌的食品最多的是乳制品，乳制品中最常用的益生菌有保加利亚乳杆菌、乳酸菌、双歧杆菌等。益生菌影响健康所需的量取决于益生菌种类和菌株以及需要什么样的健康程度，不同的益生菌起着不同的功效，有些在益生菌的数量达到每天5 000万个活细胞时有效，而另一些则在超过一万亿个活细胞时有效[35]。

在DOWARAH R等[31]的实验中筛选出具有促进消化吸收的益生菌有利于益生菌乳制品的开发。马欣莹等[36]利用筛选出来的具有降解苯丙氨酸能力的植物乳杆菌YZX21和动物双歧杆菌F1-7进行生产低苯丙氨酸发酵乳的潜力评价，结果显示，植物乳杆菌YZX21和动物双歧杆菌F1-7均具有良好的胃肠道耐受性、自聚集和粘附能力。该研究筛选得到的植物乳杆菌YZX21具有明显的苯丙氨酸降解活性，而且具有优良的发酵特性与益生特性，为针对苯丙酮尿症的特医食品的研究与开发奠定了基础。LOULOUDA A B等[37]通过实验研究发现，富含干酪乳杆菌的葡萄干、苹果片和小麦谷物等物质以新鲜和冷冻干燥的形式掺入酸奶中，可以生产一种新型益生菌乳制品。葡萄干、苹果片和小麦谷物改善了嵌入的酪蛋白乳杆菌细胞的活力，又由于其持水能力而呈现出较少的脱水作用，具有改善的感官和营养特性。

3.2 含益生菌的果蔬汁

因水果、蔬菜里含有大量的维生素、矿物质、膳食纤维等物质，且此类物质是非常适合益生菌生长的基质，有关益生菌用于加工果蔬汁产品不断增多，且益生菌饮料生产发酵过程中抗氧化活性增强，提高了饮料的营养价值。在一些益生菌发酵实验中发现益生菌可以改变果蔬汁的pH值、产生香味成分和各种有利于人体健康的维生素、矿物质等，改善产品的感官品质和营养价值。同时益生菌可以使果蔬汁中少量的酚类结合态转化成游离态，使酚类的游离态增多，从而可以提高果蔬汁的抗氧化能力[38]。因此未来可以利用益生菌的抗氧化功能更好的应用到益生菌果蔬汁的开发中。

3.3 含益生菌的肉制品

随着科技的进步，出现了利用益生菌设计新型功能性肉制品的策略，它主要集中应用在发酵香肠上。研究发现传统的肉类发酵剂中含有乳酸菌和葡萄球菌的混合物，用于保持香肠的安全性和感官特性[39]。CAMILA V B等[40]将筛选出的干酪乳杆菌SJRP66和SJRP169分别添加到低脂发酵香肠中，结果表明益生菌的添加对油脂氧化和产品色度值没有影响。这些益生菌菌株在低脂发酵香肠中表现出很好的应用前景。发酵香肠的基质结构能够有效地保护益生菌的生存，具有延续性，但前提是需要益生菌有极强的耐受力来抵制在加工过程中所遇到的高盐度，低pH等因素[41]。所研发出来的益生菌肉制品不仅具有营养高、利于肠道的消化吸收、具有特殊的发酵风味还具有益生菌特殊的优势并且能够长期保藏。

3.4 益生菌制剂

益生菌制剂现如今也已成为热门的食品产业，发展较快的主要是日本和一些欧美国家。根据益生菌不同功能研发出的益生菌制剂保健品已有上百种，主要是用于改善肠道功能、增强免疫力、改善胆固醇、防止高血压、预防癌症等方面，以及改善餐后高血糖和脂肪组织代谢调节碳水化合物和脂质代谢[42]。目前国内的益生菌制剂保健品主要以调节肠道菌群、增强免疫力功能为主，其他应用上较少，且主要的活菌产品类型有粉末型、胶囊型和口服液型等。我国卫生部批准可用于保健食品的益生菌（卫办监督发〔2001〕84号）主要有：乳杆菌类（保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等）、双歧杆菌类（两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌等）、革兰氏阳性球菌（嗜热链球菌）、真菌类（酿酒酵母、红曲霉等）。后来于2010年（卫办监督发〔2010〕65号）发布了《可用于食品的菌种名单》，并在随后几年以公告形式对名单进行了增补，未来我国益生菌制剂的发展大有前景。

4 总结与展望

我国益生菌行业现如今处于高速发展时期，益生菌在普通食品中的使用越来越多，益生菌产业在快速发展的同时也面临着一些问题和困难，如益生菌食品缺少标准规范等。虽然目前有大量益生菌食品上市，但部分产品或多或少存在一些问题：如产品里面添加的菌种并非真正意义上的益生菌，可能是益生菌的衍生物等、产品存在掺杂掺假的行为、产品加入的菌种数量不达标等问题。另外益生菌菌种保存过程中会存在一些问题，如活力下降和质量变化等。未来相关科研人员可以进一步挖掘丰富的益生菌资源、开发种类繁多、产品功效明确的益生菌产品，满足消费者对食品多元化、健康化的需求；可以进一步开展对微生物菌种保藏技术的研究和保护性化合物的开发。相关政府机构对益生菌产业的良好发展进行进一步引导和支持，有必要建立相关的法律法规，同时加大科研投入和产业政策支持，促进益生菌产业的健康发展。