NR2B亚基磷酸化在缺血/低氧神经保护中的作用

刘晓蕾姜树原邵 国谢雅彬贾小娥谢 伟*

(1.包头医学院药学院,内蒙古 包头 014040;2.内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室,内蒙古 包头 014040;3.泰国格乐大学国际学院公共卫生学系,泰国 曼谷 10220;4.深圳市龙岗区第三人民医院转化医学中心检验科,广东 深圳 518112)

N-甲 基-D-天 冬 氨 酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体是中枢神经系统(central nervous system, CNS)的离子型谷氨酸受体,介导广泛的脑过程,例如突触可塑性和兴奋性毒性[1-2]。NMDA受体存在于神经元和神经胶质细胞中,由不同亚基组成的异聚体组装而成的,包含结构亚基NR1,调控亚基NR2(NR2A、NR2B、NR2C和NR2D),以及NR3亚基(NR3A和NR3B)[3]。其中NR2B的C端区域,有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基,是敏感的磷酸化位点。此外,NR2B磷酸化的变化可能是缺血/低氧神经保护的重要表现形式,NR2B通过磷酸化影响与其相互作用的蛋白活性,进而调控的下游分子来实现对抗低氧/缺血脑损伤,并可能成为治疗低氧/缺血疾病的潜在靶点。但由于NR2B的磷酸化位点众多,其磷酸化与低氧/缺血神经保护间的关系复杂,还需要更多的研究来阐明。本文综述了NR2B的磷酸化及信号通路在缺血/低氧神经保护中作用,以期为将NR2B亚基作为调控靶点进行低氧/缺血脑疾病的防治工作奠定理论基础。

1 NR2B亚基结构、分布

NR2B亚基是NMDA受体的调节亚单位,由1456个氨基酸组成,分子量约为170～180 kDa,包含4个不连续的结构:(1)胞外N-末端结构域(Nterminal domain, NTD),在谷氨酸受体寡聚化和调节中起作用;(2)胞外配体结合结构域(ligandbinding domain, LBD),结合激动剂;(3)膜区,包括三个跨膜螺旋(M1、M3和M4)和一个环状结构(M2),形成离子通道;(4)参与连接受体的胞内C-末端结构域(C-terminal domain, CTD),参与细胞运输和耦合到各种细胞内信号通路[4-7]。

NR2亚基基因表现出不同的区域和发育表达模式。许多研究者已经在不同的大脑区域(如皮层、海马、小脑和下丘脑)的不同发育阶段检测了NR2B的表达和定位[8]。对啮齿类动物大脑中NR2B亚基基因表达的进一步检测表明,胚胎第14天,在脊髓和下丘脑NR2B mRNA低水平表达,到胚胎第17天,NR2B转录本表达显著增加,在大脑皮层(特别是第1层)、丘脑和脊髓中表达量高,而在海马、丘和下丘脑中表达量低。出生时,NR2B mRNA的表达在大脑皮层、海马、隔、新纹状体和丘脑核中明显增加,但在小脑中水平较低。出生后第7～12天,NR2B在大脑皮层和海马中表达量高,在新纹状体、隔、丘脑核和小脑中表达量中等[3]。NR2B亚基mRNA在3～30月龄时在大脑皮层大部分区域和齿状回颗粒细胞中显著降低。在成人大脑中,NR2B在皮层(尤其是II/III层)、海马、杏仁核、丘脑腹侧核和嗅球中表达最高[9]。亚细胞水平,NR2B在突触,突触周围和突触外位点检测到。然而,在大多数神经元中,突触后密度的树突棘高于树突轴和体细胞膜。在未成熟的谷氨酸突触中NR2B的受体占主导地位并直接介导突触传递[10]。

2 缺氧/缺血神经保护与NR2B关系

缺氧是指细胞维持内在生命活动的氧气浓度的下降。由于限制组织的血液供应而导致的缺氧被称为缺血。脑缺血的主要特征之一是兴奋性毒性,当缺氧/缺血发生时,导致谷氨酸大量释放,过度激活NMDA受体,并导致大量钙离子流入离子受体。然后,钙依赖的死亡信号蛋白的激活引发了大量的兴奋毒性信号级联反应,并诱导神经元死亡[11]。NR2B主要分布于突触外NMDA受体位点,NR2B亚基的CTD在促进脑缺血中的神经元死亡方面至关重要[12]。有研究证明,在缺氧缺血6 h后,脑室下区(subventricular zone, SVZ)NR2B的表达量升高,在缺氧缺血24 h时达到最大值[13],表明缺氧缺血促进了NR2B表达,导致了脑损伤。Zhang等[14]使用四血管闭塞缺血模型评估了严重缺血后大鼠受体基因表达、蛋白水平和功能。缺血后12 h和24 h,CA1和海马其他亚区NR2A、NR2B mRNA表达下降,与对照组相比,NR2A/B蛋白(海马总)在缺血后6 h和24 h均显著降低。然而缺氧1 h后,额叶皮质、海马、丘脑、基底节或小脑区域的NR2B的表达没有变化[15]。缺血再灌注(ischemiareperfusion, IR)后,CA1区NR2B的mRNA表达在12 h时下降到最低水平,然后开始恢复,到48 h达到峰值,然后持续下降到第7天。在CA3区和齿状回中,mRNA表达的变异范围逐渐显著减小。TUNEL染色显示IR 24 h时,凋亡阳性细胞主要分布在CA1区。随后凋亡阳性细胞数量持续增长,在IR 48 h时急剧增加,72 h时达到峰值,随后凋亡阳性细胞数量开始减少,到第7天时凋亡阳性细胞仍然存在。表明脑缺血大鼠海马中NR2B mRNA的表达与凋亡之间存在特定的关系[16]。可能由于低氧/缺血过度刺激了突触外NMDA受体,导致钙超载和线粒体功能障碍,从而触发一系列下游神经毒性级联反应,损害神经元功能或引起谷氨酸兴奋毒性导致细胞死亡[17]。其中,NR2B-PSD95-nNOS通路是缺血性卒中特征明确的死亡信号通路,在这个通路中,脚手架蛋白突触后密度-95(g protein postsynaptic density-95, PSD95)将NMDA受体连接到下游分子,包括一氧化氮合酶(nNOS)。PSD95包含3个PDZ结构域,PSD95的PDZ1和PDZ2结构域直接结合在NR2 NMDA受体亚基的胞内C端苏氨酸/丝氨酸-X-缬氨酸-COOH(threonine/serine-X-valine-COOH, T/SXV)基序上[18]。PSD95的PDZ2结构域也与nNOS的N端结合[19]。这种分子结构允许过度激活的NMDA受体的Ca2+内流导致nNOS的过度激活,然后产生一氧化氮(NO),这是一种已知的兴奋毒性效应[20]。nNOS促进一氧化氮的产生,进而诱导 s-亚硝基化和基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein-9, MMP-9)的激活,最终诱导神经元凋亡。干扰NR2B-PSD95-nNOS复合物可抑制NMDA介导的NO生成,保护神经元免受兴奋性毒性[21]。

相反,亚毒性NMDA通过激活促存活的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)/Akt通路对抗缺血性脑损伤从而发挥神经保护作用。NMDA受体打开后,Ca2+和钙调素激活PI3K,使膜磷脂PtdIns(4,5)P2磷酸化至PtdIns(3,4,5)P3[22]。然后,PtdIns(3,4,5)P3相互作用的磷酸肌苷依赖蛋白激酶1(phosphoinositide dependent protein kinase1, PDK1)被招募到细胞膜上,通过磷酸化激活Akt[23]。Akt通过磷酸化一些下游靶点来促进细胞存活。突触NMDA受体的激活也可诱导促生存基因的表达。突触NMDA受体活性以及Ca2+内流激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, Ras/ERK)信号和核Ca2+/钙调蛋白依赖蛋白激酶(Ca2+/calmodulin dependent protein kinase, CAMKs),然后磷酸化并激活环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)。CREB的激活可诱导促生存基因的表达,从而保护神经元免受凋亡的损害[24]。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)-酪氨酸受体激酶B(tyrosine kinase receptor B, TrkB)信号和钙依赖性钙调素级联有助于NMDA诱导的PI3K/Akt通路激活[25]。缺血预处理的实验中,通过下调NR2B,胞浆Ca2+降低,触发PI3K/Akt/GSK3β信号通路,抑制MMPs活性,减少细胞凋亡[26],从而在体内保护大脑免受损伤,改善新生儿缺氧缺血脑损伤的长期学习和记忆能力,同时在体外也能保护海马神经元[27]。尽管大多数研究表明NR2B在缺氧缺血性脑病中具有促死亡作用,但也有证据表明NR2B在发育过程中可以促进神经元的发生,保护神经元免受凋亡[13,28]。由于含有NR2B的NMDA受体是早期发育中的主要亚型,因此NR2B是否在缺氧缺血性脑病中起双重作用仍有待确定。

3 低氧/缺血神经保护与NR2B磷酸化关系

3.1 丝氨酸/苏氨酸

蛋白质磷酸化是调节NMDAR功能的重要机制。NR2B的CTD区域,是磷酸化的关键区域,包含很多能被磷酸化修饰的氨基酸,如丝氨酸、苏氨酸等,如:S886、S917、S1303、S1323[29]、S1284[30]。NR2B的磷酸化变化在神经保护中起着重要的作用。

神经元缺血时,NR2B亚单位S1284受细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)调节,培养海马神经元的氧-葡萄糖剥夺(OGD)和小鼠的短暂全脑缺血都会导致S1284处NR2B磷酸化水平的显著下降[30]。再灌注后24 h内,NR2B的表达随着时间的推移而降低,酪蛋白激酶2α(casein kinase 2α, CK2α)介导的丝氨酸S1480磷酸化逐渐降低,S1480的磷酸化破坏了NR2B与PSD-95之间的相互作用[29]。Tu等[31]发现激活的死亡相关蛋白激酶1(death-associated protein kinase 1, DAPK1)通过磷酸化NR2B上的S1303位点来提高NR2B受体通道的电导。在该研究中,研究者发现缺血损伤后激活DAPK1可使NR2B的S1303磷酸化,并且OGD和缺血处理的小鼠和皮质神经元细胞,都会引起DAPK1的活性增高并提高NR2B的S1303位点的磷酸化水平,从而导致神经元死亡。通过S1303位点附近基序的多肽干扰DAPK1和NR2B的相互作用,可以减少脑缺血带来的损伤。综上,NR2B上丝氨酸位点的磷酸化参与调控了NMDA受体的通道特性,在低氧/缺血类脑病中,不同丝氨酸位点的磷酸化变化不尽相同,如S1303处NR2B的磷酸化水平会升高,而S1284处NR2B磷酸化水平会下降,通过改变这些位点的磷酸化水平,对低氧/缺血类脑病,特别是脑卒中有积极的治疗作用。

3.2 酪氨酸

酪氨酸磷酸化在低氧/缺血类疾病中,特别是脑卒中,发挥着重要作用。Nakazawa等[32]通过一系列方法鉴定出了NR2B上许多酪氨酸磷酸化位点,主要包括酪氨酸Y1070、Y1472、Y1252、Y1336等。为了探究酪氨酸磷酸化在脑卒中之中的变化,大量研究通过建立低氧/缺血模型,模拟脑卒中。有研究表明,在成年大鼠中,短暂性缺血会显著增加海马内NMDAR亚基NR2A和NR2B的酪氨酸磷酸化(NR2A的酪氨酸磷酸化显著、快速和持续增加,而NR2B的酪氨酸磷酸化较小[33])。这种上调部分是由Src家族酪氨酸激酶Src和Fyn介导的[34]。Fyn在大脑中有许多底物,包括NR2B,它是发育中大脑中的主要调节亚单位。Fyn在其C末端的7个酪氨酸(Y932、Y1039、Y1070、Y1109、Y1252、Y1336、Y1472)残基上介导NR2B磷酸化,其中Y1472为主要位点[32]。Fyn优先磷酸化新生皮质中Y1472和Y1252处的NR2B。此外,Y1472处NR2B的磷酸化(pY1472 NR2B)和Y1252处NR2B的磷酸化(pY1252 NR2B)在Fyn 过表达小鼠的突触膜中上调,其中Src家族激酶(SFK)活性也增加。在脑缺血的成年大鼠中,pY1472 NR2B显著且持续上调[35]。出生后第7天(P7)大鼠和小鼠缺氧缺血hypoxia ischemia, HI)后pY1472 NR2B增加[36]。研究表明,再灌注后24 h内,NR2B的表达随着时间的推移而降低,Fyn介导的Y1472磷酸化增加,而NR2B上另一个Fyn靶点Y1336的磷酸化保持不变[37]。在WT动物中,HI后6 h内pY1472 NR2B和pY1252 NR2B增加,但pY1336 NR2B没有增加[36]。Wu等[38]发现Fyn对pY1336在体外谷氨酸毒性模型中促进NR2B的钙蛋白酶裂解,然而HI后没有观察到pY1336产生的钙蛋白酶裂解片段[36]。据报道,pY1336还介导NR2B与PI3K的相互作用,该相互作用在成年大鼠短暂缺血后增加[39-40]。新生儿低氧/缺血性脑病与NR2B酪氨酸磷酸化的增强有关。新生儿缺氧缺血后pY1472 NR2B上调参与了超氧化物介导的氧化应激,并促进了脑损伤。HI后,pY1472 NR2B的上调,可能启动了下游细胞死亡信号通路,促进了脑损伤的形成,而pY1336可能参与钙剪切酶对NR2B胞内端剪切的调控。综上,在脑卒中和新生儿低氧/缺血性脑病中,NR2B上酪氨酸位点的磷酸化水平的变化不同,但是NR2B主要的酪氨酸磷酸化位点的磷酸化水平是升高的,通过改变这些位点的磷酸化水平,可以为治疗缺血缺氧性脑病奠定基础。

4 结语

总之,NR2B的磷酸化影响了NMDA受体的功能,酪氨酸的磷酸化改变很可能影响NR2B复合体在初始状态和损伤后的蛋白质招募[41],丝氨酸和苏氨酸的磷酸化调控NMDA受体通道特性和膜转运过程,这为以NR2B的磷酸化位点进行低氧神经保护提供了思路,若进一步研究NR2B的磷酸化位点氧/缺血神经保护间的关系,能为缺血性卒中等疾病的诊断、治疗开辟更广阔的的天地。