免疫检查点阻断转化医学研究进展

何军芳

（上海旭东海普药业有限公司 上海 201206）

阻断T细胞免疫检查点通路是肿瘤治疗策略之一，但现仅小部分患者能自此类免疫治疗中获益，相关药物主要包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、程序性细胞死亡受体-1（programmed cell death-1，PD-1）和程序性细胞死亡受体配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制剂等。抑制性免疫检查点CTLA-4和PD-1除了调控急慢性炎性反应、抗肿瘤等免疫反应之外，还与机体免疫耐受相关，在保护机体免受自身免疫反应方面起着重要作用。因此，使用免疫检查点抑制剂治疗会导致发生不同程度的免疫相关不良事件。为使更多肿瘤患者从免疫治疗中获益，改善患者预后，国内外开展了大量的免疫检查点阻断相关的转化医学研究。本文以抗肿瘤免疫反应相关的代表性免疫细胞为例，包括树突状细胞、耗竭CD8+T细胞（exhausted CD8+T cells，Tex细胞）和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg细胞），概要介绍免疫检查点阻断相关的转化医学的研究进展。

1 肿瘤调控树突状细胞抗原提呈以逃避免疫识别

CD8+T细胞是特异性抗肿瘤免疫反应的主要功能性细胞，而树突状细胞在抗肿瘤T细胞免疫的启动和维持中起着核心作用，是体内抗原提呈能力最强的一类细胞。在抗肿瘤免疫反应过程中，树突状细胞首先摄取肿瘤抗原并通过人白细胞抗原Ⅰ（classⅠhuman leukocyte antigens，HLA-Ⅰ）交叉提呈以启动初始CD8+T细胞，启动后的CD8+T细胞对由HLA-Ⅰ直接提呈的肿瘤抗原进行免疫识别，进而杀伤肿瘤细胞[1]。

肿瘤内的自然杀伤细胞通过分泌趋化因子CCL5和XCL1招募树突状细胞中的传统1型亚群（conventional type 1 dendritic cells，cDC1）进入肿瘤微环境[2]。cDC1摄取已死亡肿瘤细胞释放的特异性抗原后不断成熟，迁移至肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymph node，TDLN）后对肿瘤抗原进行加工处理，然后加载至HLA-Ⅰ，交叉提呈于CD8+T细胞，同时上调共刺激分子CD80等表达并产生促炎细胞因子，充分启动初始T细胞[3]。

自然杀伤细胞-cDC1轴与肿瘤患者的远期生存相关，而肿瘤源性前列腺素E2能减弱自然杀伤细胞的功能，使其趋化因子产生减少，并下调cDC1趋化因子相关受体的表达，导致cDC1招募减少[2]。在对免疫检查点抑制剂耐药的肿瘤内有一类富含免疫调节分子的成熟树突状细胞，研究发现存在肿瘤抗原摄取相关的调节程序：由受体酪氨酸激酶AXL诱导PD-L1表达上调，白介素-12表达上调则严格依赖于干扰素-γ水平并受白介素-4信号传导的负向调控，由此减弱cDC1的免疫功能，从而限制TDLN中的T细胞活化[4]。此外，肿瘤内树突状细胞的氧化脂质水平升高，并可通过与热休克蛋白70共价结合，介导抑制树突状细胞对肿瘤抗原的交叉提呈[5]。

总之，肿瘤细胞能利用多种免疫逃逸机制在肿瘤抗原提呈过程中逃避免疫识别及杀伤，它们除可直接调控自身抗原加工和下调HLA-Ⅰ表达之外，还可通过影响cDC1招募、成熟和抗原交叉提呈等环节，抑制cDC1的抗肿瘤免疫功能。因此，肿瘤区域的树突状细胞经常呈现功能失常、耐受性甚至免疫抑制性表型。对经免疫检查点抑制剂治疗反应不良的免疫抑制性肿瘤，联用干扰素基因刺激因子激动剂可以克服免疫抑制信号并诱导树突状细胞成熟，提高免疫治疗效果[6]。

2 阻断树突状细胞PD-L1可增强T细胞CD28信号传导

研究发现，通过PD-L1激活PD-1信号通路，募集蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2，可使T细胞共刺激受体CD28去磷酸化，从而阻断CD28信号传导，抑制T细胞活化，表明PD-L1/PD-1信号通路主要通过减弱CD28的共刺激信号而调节效应T细胞的功能[7]。

树突状细胞表达的PD-L1既可与T细胞的PD-1结合，由此传递抑制性信号，也可与自身的B7-1（CD80）发生相互作用，进而阻断B7-1/CD28共刺激信号，抑制T细胞活化和细胞因子产生[8]。PD-L1/B7-1的亲和力介于B7-1/CD28和B7-1/CTLA-4之间[8]。

进一步的研究发现，肿瘤相关树突状细胞的PD-L1表达水平高于B7-1，且其PD-L1可与B7-1顺式结合，而其他游离的PD-L1则与T细胞的PD-1反式结合[9]。给予抗PD-L1抗体除了可阻断PD-L1/PD-1抑制性信号传导之外，还可破坏PD-L1/B7-1的顺式结合，释放被PD-L1结合的B7-1，使得B7-1能与CD28结合而提供共刺激信号，增强T细胞启动[9]。实验表明，给予抗PD-1抗体后，CD28的信号传导增强了32%；再加用抗PD-L1抗体，CD28的信号传导增幅提高至52%[9]。临床上观察到，在接受阿替利珠单抗治疗的肾细胞癌和非小细胞肺癌患者中，肿瘤相关PD-L1+树突状细胞的存在与患者临床获益增加相关，这与上述基础研究结果一致[9]。

此外，有研究证实，敲除树突状细胞的PD-L1可显著限制肿瘤生长，增强抗肿瘤CD8+T细胞免疫反应[10]。尽管肿瘤微环境中的巨噬细胞、树突状细胞和部分肿瘤细胞均可表达PD-L1，但树突状细胞表达的PD-L1在抗肿瘤免疫中起着关键作用[10]。该研究结果同样确认了树突状细胞在PD-L1/PD-1信号通路中的重要作用，有助于更深入地理解通过免疫检查点阻断治疗肿瘤的机制。

3 阻断PD-1信号通路可扩增具有循环潜能的Tex细胞亚群

与急性感染或接种疫苗后初始CD8+T细胞活化成为效应T细胞和记忆T细胞，进而发生有效的免疫应答并形成免疫记忆不同，慢性感染或肿瘤患者体内的T细胞因持续暴露于抗原或炎症信号，CD8+T细胞常呈现耗竭状态（Tex细胞），主要表现为逐渐丧失免疫效应功能、持续高表达抑制性受体、代谢失调、无法形成免疫记忆和稳态自我更新差，以及明显改变了的转录和表观遗传特征[11]。

鉴于Tex细胞的异质性，有研究者结合相关转录因子和细胞活化标志物表达衍变，确定了由Ly108［转录因子T细胞因子1（T cell factor 1，TCF1）表达的替代标志物］和CD69（与细胞增殖负相关）定义的Tex细胞的4阶段发育轨迹，即Tex祖细胞1（Ly108+CD69+，Texprog1）、Tex祖细胞 2（Ly108+CD69-，Texprog2）、Tex中间体细胞（Ly108-CD69-，Texint）和 Tex终末期细胞（Ly108-CD69+，Texterm）[12]。Texprog1受限于淋巴组织且呈静止状态，其不能进入血液循环，但可与Texprog2相互转化；Texprog2可启动细胞周期并能进入血液循环，在细胞分裂及转化为Texint过程中逐渐丧失TCF1表达，同时转录因子Tbet表达显著上调；Texint与可进入血液循环的真正的效应T细胞较为相似，尽管在表观遗传方面并不相同；Texint在转录因子Tox的调控下最终转化为Texterm，后者逐渐丧失免疫效应功能[12]。在Ⅳ期转移性黑色素瘤患者中使用T细胞受体αβ作为分子条码，显示血液循环中克隆扩增的抗肿瘤CD8+T细胞表达免疫效应功能的基因特征，而与之匹配的肿瘤浸润性T细胞表达终末期耗竭的基因特征[13]，基本对应于上述研究中的Texint和Texterm。

研究发现，阻断PD-1信号通路可优先扩增具循环潜能的Tex细胞亚群，Texprog2和Texint的数量分别增加了17和10倍，且阻断PD-1信号通路可促进Texprog2转化为Texint[12]。一项对基底细胞癌或鳞状细胞癌患者在接受PD-1抑制剂治疗前后的克隆T细胞动力学分析显示，具有耗竭表型的CD8+T细胞的克隆扩增并非源自预先存在的肿瘤浸润性T细胞，而是出现了新的肿瘤特异性T细胞的克隆替代[14]，这与阻断PD-1信号通路后扩增的新的Texint可转化为Texterm的推演相符。

T细胞耗竭伴随代谢失调，PD-1交联会减弱磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的信号传导，抑制有氧糖酵解；与此同时，肿瘤细胞与Tex细胞争夺葡萄糖以启动有氧糖酵解，并导致大量乳酸蓄积于肿瘤微环境，使Tex细胞进一步耗竭[11]。阻断PD-1信号通路可让具有一定免疫效应功能的Texint的葡萄糖摄取增加，满足其增殖和恢复活力所需的生物能量需求，从而增强抗肿瘤免疫反应[12，15]。

CD8+T细胞耗竭是目前临床上开展肿瘤免疫治疗所遇到的主要问题，严重影响了通过阻断PD-1信号通路治疗肿瘤的临床效果。通过转录/表观遗传TCF1-Tbet-Tox轴调控的Tex细胞的发育轨迹，可充分了解Tex细胞亚群的异质性及其相关特征的动态变化情况。然而，新近研究认为，调控Tex祖细胞向效应样T细胞转化的核心转录因子为BATF而不是Tbet[16-17]。总之，通过调控转录/表观遗传的方式，促进Tex祖细胞转化为具有一定免疫效应功能的Texint，并使之较长时间地停留于此阶段，或者避免嵌合抗原受体T细胞发生耗竭，更好地发挥CD8+T细胞的抗肿瘤作用，是上述几项研究开展的共同目的。

4 肿瘤微环境有助于稳定Treg细胞的免疫抑制功能

随着肿瘤免疫治疗从最开始用于晚期肿瘤、术后辅助治疗，逐步拓展至也用于术前新辅助治疗，与此类治疗相关的免疫相关不良事件越来越为人熟知，与之密切相关的Treg细胞受到临床关注。Treg细胞属于CD4+T细胞中具有免疫抑制功能的细胞亚群，其主转录因子为叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3），可识别自身抗原并形成免疫耐受，在维持机体免疫稳态中起着重要的作用[18]。

与CD8+T细胞活化后诱导表达CTLA-4不同，FOXP3+Treg细胞组成型表达CTLA-4，CTLA-4在Treg细胞发育中起着关键作用[19]。Treg细胞可借助CTLA-4通过跨内吞作用从树突状细胞表面去除CD80和CD86，从而移去T细胞活化所需的共刺激信号[19]。此外，CTLA-4可抑制PI3K-蛋白激酶B信号通路，以避免Treg细胞向致病性1型辅助性T细胞样细胞转化而引发自身免疫疾病[19]。肿瘤浸润性Treg细胞同时高表达PD-1，与CTLA-4等抑制性免疫检查点一起抑制PI3K-蛋白激酶B信号通路，抑制细胞增殖，维持Treg细胞免疫抑制功能的稳定性[19]。

Treg细胞的免疫抑制功能可能被肿瘤细胞利用，从而逃避机体免疫监视。对116份黑色素瘤样本的分析证实，在存在极高肿瘤抗原负荷的情况下，黑色素瘤细胞可表达人白细胞抗原Ⅱ，向Treg细胞提呈肿瘤抗原，直接激活和扩增Treg细胞，调控局部免疫抑制微环境，最终发生免疫逃逸[20]。

肿瘤细胞和肿瘤浸润性CD8+T细胞由于细胞增殖的代谢需求，在肿瘤微环境中均可转换为高度糖酵解代谢方式（Warburg反应），但在葡萄糖摄取方面，肿瘤细胞远胜于CD8+T细胞[21]。相比之下，FOXP3+Treg细胞更能从氧化磷酸化中获取能量，从而维持自身的免疫抑制功能[21]。研究发现，肿瘤内Treg细胞可通过上调甾醇调节元件结合蛋白的活性、协调脂质合成而增强Treg细胞的功能，上调PD-1的表达，增强抑制性受体的信号传导[22]。

在高度糖酵解导致的低葡萄糖、高乳酸水平的肿瘤微环境中，Treg细胞能通过单羧酸转运蛋白1主动摄取乳酸，促使活化T细胞核因子1移位进入细胞核，从而上调PD-1表达，同时抑制效应T细胞的PD-1表达[23]。此时，阻断PD-1可激活表达PD-1的Treg细胞，导致免疫治疗失败，提示可同时将Treg细胞的单羧酸转运蛋白1作为干预靶点[23]。在呈低糖酵解状态的肿瘤微环境中，阻断CTLA-4可导致Treg细胞表型和功能不稳定，产生干扰素-γ和肿瘤坏死因子，增强肿瘤特异性CD8+T细胞免疫反应，提示CTLA-4抑制剂联用特异性肿瘤有氧糖酵解抑制剂能提高对高度糖酵解肿瘤免疫治疗的效果[24]。

5 展望

肿瘤免疫治疗借助机体免疫反应清除肿瘤细胞，肿瘤免疫治疗药物的作用机制远较激酶抑制剂等肿瘤靶向治疗药物复杂。参与肿瘤免疫治疗的树突状细胞、CD8+T细胞和Treg细胞在维持机体免疫稳态中各有各的作用，人为阻断免疫检查点进行干预必然会对机体免疫稳态造成不同程度的影响。肿瘤免疫治疗过程中伴随发生的免疫相关不良事件可能与外周Treg细胞消耗或其免疫抑制功能减弱相关，这在临床上使用可介导抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cytotoxicity，ADC）的CTLA-4抑制剂伊匹木单抗治疗时表现得尤为明显[25]。在伊匹木单抗单药用于黑色素瘤术后辅助治疗的Ⅲ期临床试验中，高达54%的患者发生了3～5级治疗相关不良事件，使之临床应用受到严重限制[26]。而另一个无ADC效应的CTLA-4抑制剂曲美木单抗单药治疗黑色素瘤等的临床试验均以失败告终，提示阻断CTLA-4的治疗机制比较复杂且存在不确定性。阻断PD-1可导致CD8+T细胞和Treg细胞的早期活化和增殖，临床上观察到小部分晚期胃癌患者治疗期间出现肿瘤超进展现象，提示阻断PD-1对CD8+T细胞和Treg细胞的相对影响可能在决定临床疗效方面起着重要作用[27-28]。总之，对于阻断CTLA-4、PD-1等免疫检查点进行持续、深入的转化医学研究，有助于实现肿瘤免疫治疗的精准化和个体化，在提高临床疗效的同时减少免疫相关不良事件的发生，更好地改善患者的预后。