PCR 技术及其在食品微生物检测中的运用策略

2023-04-05◎薛磊

现代食品 2023年2期

◎薛磊

（山西开放大学，山西太原 030000）

当前，我国的饮食结构发生了显著变化，为了满足消费需求，市场中的食品类型越来越多样化。为了保障食品安全，必须强化食品质量安全检测工作，而食品微生物含量检测是食品检测工作中的重要组成部分，因为诸多食物腐烂变质的原因就在于微生物含量超标，一旦食用，极易损害人体健康，甚至威胁生命，所以必须针对食品微生物进行有效检测。在此过程中建议应用PCR 技术，因为其具有高效性和准确性的特点，可以有效提升食品微生物检测工作的质量和效率[1]。

1 PCR 技术

1.1 概念和原理

PCR 技术诞生于1985 年，一经问世即成为基因工程中的主要技术手段之一，食品微生物检测工作也因此更加便捷和有效。当前，我国对于PCR 技术的应用已经发展至针对各类日常食品的微生物含量进行检测。PCR 技术的基本原理如下：在PCR 体系下加热食物，如果食物中含有微生物，则相应的核酸序列能够受到温度变化影响，出现变形情况。通常情况下，PCR 体系投入应用的初始阶段，可以将其温度调节至94 ℃，微生物DNA 能在此温度环境下裂解成为单链，但是需要注意对PCR 体系中的温度进行合理控制，若温度过高，则会直接杀死微生物。在微生物DNA 裂解成为单链以后，再进行降温处理，将PCR 体系温度调节至55 ℃，之后再调节至72 ℃，使引物与模板DNA 结合，DNA 聚合酶则可合成新DNA 链，之后反复进行上述步骤，确认检测对象中有无特异性DNA 片段，即可确定食品中有无微生物以及微生物含量。同时，特异性引物只能在微生物上生长，且检测便捷性大于微生物，所以应用PCR 技术的便捷性和准确性均更高[2]。

1.2 原料

在应用PCR 技术的过程中，需要应用的原料主要包括引物、dNTPs、DNA 聚合酶、缓冲液、Mg++、核酸模板。

2 以PCR 技术为基础的检测方法

PCR 技术当前已经在食品微生物检测工作中得到了广泛应用，可针对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等多种微生物进行准确检测，还可对食品样品中的物质进行微量检测工作，可精确至1 pg[3]。可见PCR 技术在食品微生物检测中，能够呈现较高的应用价值。以此为基础，将PCR 技术实际应用于食品微生物检测工作中，可以根据其主要形式划分为不同的检测方法。

2.1 常规PCR 检测法

将目标物质相应的DNA 模板以及引物混合，再加入适量聚合酶。在适宜的温度环境和催化条件下，聚合酶可以加速目标物质DNA 模板序列的扩增，经过数次DNA 复制，即可获取DNA 片段，且这一DNA 片段即循环DNA 模板，可继续复制和扩增。将目标物质放大以后，针对其中的特定DNA 开展标记测定工作，即能够获取物质中的微生物含量。

2.2 多重PCR 检测方法

将多个模板与多条引物混合于同一反应体系中，并分别进行特异扩增，形成不同的目的条带，或是单一模板DNA 与多条引物在一个反应系统中，针对同一模板中的不同片段进行扩增，也可针对超长片段实施扩增处理[4]。相对于常规形式的PCR 检测方法，其能够呈现产物特异性高、扩增效率高以及经济简便等优势，适用于食品检测工作中多种致病菌的检测。

2.3 PR-PCR 检测方法

该检测方法属于常规PCR 检测方法的变形，首先针对检测目标中的一条RNA，将其逆转录并获取能够与其互补的DNA，然后将DNA 链作为模板，使用常规PCR 技术扩增复制DNA。在这一过程中，难点为RNA的逆转录，必须保障RNA 模板处于完整状态，并且其中不可含有杂质（如DNA、蛋白质等）[5]。

3 PCR 技术在食品微生物检测中的应用

PCR 技术具有灵敏度高、特异性强、准确率高的特点，因此得到了迅速发展。同时，应用范围不断得到拓展，不仅能够在基因筛选、基因克隆、制备特异探针和基因表达调控等方面进行应用，而且当前已在农业科学、医学、食品科学、考古学以及环境科学等多个领域受到了充分重视。例如，将PCR技术应用于食品微生物检测工作中，能够起到较好的应用效果。

3.1 食品样品致病菌检测

开展食品样品致病菌检测工作时，若应用传统方法，不仅过程烦琐，而且局限性显著，需要首先富集培养被检测微生物，直至其数量增长至可检测水平，方可分离微生物，并针对其形态特征进行观察，最后开展生理化鉴定。同时，对于人工培养难度较大的微生物来说，应用传统样品难以有效开展检测工作。在细菌中，编码rRNA 的基因具有较强的保守性，当应用PCR 技术时，其中的DNA 片段可以适当扩张，也就可以对样品中的细菌及致病菌进行快速且准确的检测，即使针对人工无法培养的各种微生物，也可起到良好的检测效果。在应用PCR 技术检测食品样品致病菌时，需要针对靶DNA 进行抽提，采用过滤或者离心的方式获取样品中的细菌细胞，再裂解细胞，实施核酸纯化，使其适用于PCR 技术，即可开展检测工作。

3.2 乳酸菌检测

可以产生乳酸的细菌均可被称为乳酸菌，当前多数乳酸菌属于有益菌，可起到促进胃肠消化、优化肠道功能和降低血清胆固醇含量等多方面作用，有利于提升机体免疫力和维持人体健康，但是有少数乳酸菌会对人体产生危害，所以购买食物时，消费者会仔细查看食品乳酸菌含量，所以需要准确检测食品中的乳酸菌含量。

我国针对乳酸菌检测工作的研究开展时间较早，当前已经可以明确，乳酸菌DNA 序列1 414～1 432位置上的21 个碱基排列具有显著代表性，并且多种类型的乳酸菌具有这一碱基排列，目前可以确认包含双歧杆菌在内的32 类乳酸菌均是如此。所以，针对乳酸菌含量开展检测工作的主要内容，即为针对上述的21 个碱基排列进行检测，获取这一序列时，应该使用SDS 方法裂解乳酸菌细胞，再借助蛋白酶去掉细胞中的蛋白质，即能获取乳酸菌核酸，且可保障其完整性，之后提取所需的基因片段并对相应的引物进行研究。因为这一片段为乳酸菌特有的类型，所以引物不会与其他物质结合，也就可以对乳酸菌含量进行准确检测[6]。

3.3 生活饮用水细菌检测

饮用水水质检测工作内容主要为检测大肠杆菌类以及人类粪便污染的大肠杆菌。传统的检测方式需要共同培养细菌与将要进行检测的可以利用乳糖的革兰氏阴性菌，整体过程较为烦琐，耗费时间长。若能利用-半乳糖苷酶，则可使用明确的底物开展检测工作，更有利于提升检测效率。但是，部分大肠杆菌不能对-葡萄糖醛酸苷酶进行表达，所以检测必然存在一定的失败概率，导致检测工作的效率受到影响。应用PCR技术开展-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因检测工作，其中的灵敏性和特异性可得到显著提升。由于PCR 技术可以起到扩增-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因的作用，能够从水样中分别检测到大肠杆菌类以及大肠杆菌。通常情况下，选择应用经过扩增的-半乳糖苷酶为活体开展培养工作，可以同时检测到同一类型的大肠杆菌类，而使用经过扩增的-葡萄糖醛酸苷酶进行检测，则可检测出一种大肠杆菌以及志贺氏菌。另外，应用PCR 技术，仅需数小时即可完成检测工作，准确性和效率较高[7]。

3.4 啤酒腐败菌检测

当前，我国啤酒产量大且种类多，市场广阔，啤酒生产过程中需要发酵，且乳酸杆菌在其中占据重要地位。与此同时，啤酒花中含有异A 酸，其能起到抑菌作用，能够对乳酸菌产生一定的影响。根据相关研究显示，乳酸杆菌之所以能起到抑制异A 酸生长的作用，原因在于其中含有horA 基因，这一基因易引起啤酒变质，即horA 基因能够对啤酒花产生抗性。啤酒败菌检测方法是以horA 基因顺序为基础合成相应的特异性产物，再加入DNA 聚合酶以及乳酸杆菌DNA提取液，通过电泳检测混合产物的检测方法。应用这一方法检测啤酒中的腐败菌，仅需耗时6 h，相对于传统模式下的检测,效率显著提升。