基于蛋白质组学的中医药防治脑卒中应用研究进展

马春玉 牛萍 王新娜 于子乔 于俊超 王旭 董富香 赵德喜

脑卒中是世界范围的公共卫生问题，位列全球死亡原因的第2位[1]。我国的形势更为严峻，脑卒中死亡人数约占年总死亡人数的1/4[2,3]。蛋白组测序是研究基因表达调控机制的一个重要工具[4]。近年来，研究人员在进行疾病机制阐释和新药研发的过程中，广泛应用蛋白质组学技术。在疾病研究方面，该技术对阐明肿瘤、糖尿病和呼吸系统疾病的病理过程具有重要意义[5-8]。在药物研究方面，蛋白质组学的应用为药物作用机制[9]及中药新药的研发[10]提供了新思路。在中医药防治重大疾病的研究中，越来越多科研工作者认识到应用蛋白质组学技术的重要性。通过对疾病及新药的研究，以期得到预测、治疗疾病及预测预后的生物学标志物，在此基础上开发新药物，以推进精准医学的发展和人民健康水平的提高。中医早在《内经》一书中就对脑卒中有了相关阐述，后世医书中也不乏对这一疾病的记载。总结各代医家对本病认识的相关论述，并基于现代人体质、发病特点等因素，现代中医学家们已总结出本病的病因病机，而基于病因病机而发展出来的治则、治法、方剂，指导了很多中医人的临床应用，且治疗效果显著。研究发现，脑血管病可归因于单基因遗传病的人群极少，故脑卒中损伤人体的途径并不是单一的，而是多种因素共同影响的结果[11]，如通过兴奋性氨基酸[12]、谷氨酸[13]等代谢产物的毒性作用、凋亡细胞的激活[14]、小胶质细胞活化[15]等共同作用。另外，本病伴发疾病较多，是一系列疾病共同作用的结果[16]。脑梗死、脑出血等既是国际上的重大疾病，又是疑难、复杂疾病的病种,是中西医临床与基础研究的热点。中医药疗法在治疗疾病时能够多靶点、多途径的干预疾病病理过程的发生发展，中医药在防治本病上优势显著。应用蛋白质组学技术阐释中医药防治脑卒中的研究已取得了很大的进展。本文将近10年基于蛋白质组学的中医药防治脑卒中的研究作如下综述。

1 蛋白质组学在揭示脑卒中发病机制、诊断中的应用

蛋白质组学是通过各种技术手段对蛋白质在生物体内的表达进行多层次评估，从而掌握复杂的生理病理过程[17]，即获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。近年来，蛋白质组学技术为脑卒中发病机制的研究提供了新思路，如帮助研究人员从蛋白质水平上更好地认识复杂的颅内、颅外脑血管体系损伤的可能原因，认识卒中发生相关的生物学通路[18]。越来越多的学者开始研究脑卒中发病机制及病程中的特异性标志物。

1.1 发病机制 蛋白质聚集严重影响神经退行性疾病中的细胞活力[19]，但这是否也发生在缺血性脑损伤中仍无定论，故Anja等[20]采用蛋白质组学的方法来确定脑缺血后聚集的蛋白质组，并对选定的聚集蛋白进行了验证。缺血/再灌注会诱导RNA结合蛋白和热休克蛋白、泛素、类泛素蛋白修饰分子和其他参与细胞信号转导的蛋白质的聚集。其中RNA结合蛋白构成了缺血中最大的聚集蛋白组。

大多数自发性脑出血患者并未从外科手术中获益[21]，因此，明确脑出血的发病机制，以靶向治疗本病，对ICH的治疗意义重大，而应用蛋白质组学的方法可以为脑卒中发病机制寻找特异性标志物提供新思路。

目前，神经成像和动物模型的研究提高了在分子水平上对脑出血病理、生理学的认知，并提出了神经损伤的2个阶段：早期机械损伤期和亚急性期，其共同特征是炎症和水肿。蛋白质组学有助于分析在急性脑出血患者中不同表达的血浆蛋白。Li等[22]运用血浆蛋白质组的方法研究了急性ICH的病理机制，以寻找新的生物标志物和治疗靶标，结果显示，ICH发病急性期反应信号转导以巨噬细胞途径中一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的产生为主。脂多糖(LPS)、人载脂蛋白A4(APOA4)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)、重组蛋白(LBP)、溶菌酶(LYZ)和O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)是ICH发展中新的潜在生物标志物。筛选出的蛋白质和通路为ICH潜在的病理机制和治疗靶点提供了新的视角。本研究提供了一些参与脑出血的新途径，如LXR/RXR激活、急性期反应信号转导以及巨噬细胞通路中NO和ROS的产生。在网络分析中，得出p38MAPK和NFκB与脑出血继发性损伤期的进展和恶化有关。

Rajaneekar等[23]应用定量蛋白质组学结合生物信息学，对脑出血后继发脑损伤的可能靶点及信号通路进行了研究，结果表明，细胞周期蛋白依赖性激酶5(CKI-5)、E3泛素蛋白连接酶、蛋白磷酸酶2A-α、蛋白磷酸酶2A-β、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、钙蛋白酶-8(calpain-8)、轴蛋白-1(axin-1)、隔蛋白-4(septin-4)等可能对ICH后继发的脑损伤产生作用。值得注意的是，本研究中研究人员分离了脑组织的单细胞悬液，这使得在蛋白质组学分析中能够观察到出血性脑损伤后细胞水平发生的变化，限制细胞外蛋白介导的信号掩蔽；同时，研究人员采用蛋白质组学方法结合生物信息学来分析脑出血后细胞水平上同侧脑区的分子变化。利用该方法，鉴定出假手术组和脑出血组之间的差异表达蛋白与凝血作用、纤溶酶原激活级联反应、p53通路、EGF受体信号通路、FGF信号通路等13条显著的相关信号通路。

Chen等[24]通过蛋白质组学方法探索ICH患者血肿周围组织的整体蛋白质表达谱，并确定潜在的病理生理学通路和蛋白质标志物，使用iTRAQ标记定量蛋白质组学技术，分析了4个ICH脑组织样本和4个非ICH脑组织样本，经过生物信息学分析，发现差异表达的蛋白质主要参与止血过程、营养代谢信号通路和抗氧化通路，这是对ICH诱导的继发性脑损伤机制的新发现；使用临床前或临床样本对ICH诱导的继发性脑损伤的蛋白质组学研究有揭示损伤机制的潜力，使用一个二维的iTRAQ-液体采用基于色谱-串联质谱(iTRAQ-2D-LC-MS/MS)的定量蛋白质组学方法，对ICH患者的血肿周围脑组织和年龄匹配的非脑出血对照组进行分析对ICH的潜在分子病理学可提供新的研究视角。此外，纤维连接蛋白位于PPI网络的中心，并与各种蛋白质进行通信。

1.2 预防与早期诊断 对于脑卒中预防及诊断生物标志物的研究，主要集中在提高对本病的诊断效率，优化诊断指标的时效性与速度；改善临床决策，提高药物的有效性，降低不良反应，并促进药物的个性化使用，实现精准医疗，这与中医理论中“因人制宜”相对应。目前，脑卒中的诊断主要是通过临床评估(症状、体征)和神经影像学检查实现的。故发现一种更快、更准确的诊断技术，如血液检测，对实现早期诊断、早期治疗至关重要。在先前的一些研究中，单一生物标志物或多种生物标志物的效用已经被评估，但所达到的准确性远远低于临床实践中的要求[25]。研究发现，利用蛋白质组学技术检测脑卒中的生物学标志物，有利于本病的预防及早期诊断[26]。

动脉粥样硬化的病因可归结到免疫系统。在免疫系统发生内环境改变时，会对循环内和血管病灶部位产生多方面影响，从而导致动脉粥样硬化的产生。然而，目前对导致脑梗死等临床事件的动脉粥样硬化病变内失调的免疫细胞的具体特征知之甚少。Dawn等[27]使用单细胞蛋白质组学技术，发现了与近期无卒中相比，近期有卒中或短暂性脑缺血发作的患者颈动脉斑块中T细胞和巨噬细胞的不同特征，具体表现为：CD4+T细胞的不同亚群以及被激活和分化的T细胞，来自有卒中或短暂性脑缺血发作患者的斑块中的一些T细胞亚群呈现出T细胞耗竭的标志物。来自这些斑块的巨噬细胞包含交替激活的表型，包括与斑块易损性相关的亚群。在无卒中患者的斑块中，T细胞和巨噬细胞被激活并显示出白介素1β(IL-1β)信号转导。识别与脑血管事件相关的斑块中先天性和适应性免疫细胞的特定特征，对研制出更精确的免疫疗法具有重要意义。

笔者目前尚未发现用于早期诊断缺血性脑卒中的血液生物标志物。Lee等[28]试图通过识别与潜在凝血机制相关的蛋白质来检测脑卒中特异性血液生物标志物。使用来自16名健康对照和18名缺血性脑卒中患者的血液样本进行蛋白质组学分析。运用纳米液相色谱-串联质谱法，确定了相应水平上相对于健康对照组，脑卒中患者上调蛋白质理论质谱图，以提高候选蛋白质的一致性和准确性。通路分析证实，上调的蛋白质主要参与血液凝固。其中，选择凝血酶原、纤溶酶原、纤维蛋白原α-链和富含组氨酸的糖蛋白作为候选生物标志物。对61份血清样本(31 名健康对照和30名缺血性脑卒中患者)进行反向监测分析，以评估候选生物标志物的诊断价值。结果显示，这4种蛋白质在中风患者中的表达水平都高于健康对照组，即这4种凝血蛋白对于快速而准确地诊断缺血性脑卒中具有重要临床意义。

赵新玲等[29]应用蛋白质组学技术检测和鉴定了对急性缺血性脑卒中患者有诊断和预后评估作用的潜在生物标志物血小板反应蛋白1(THBS-1)。结果表明，THBS-1在急性缺血性脑卒中患者的血浆中呈高表达，且THBS-1的表达水平与患者预后呈负相关。

2 蛋白质组学在脑卒中中医药治疗中的应用

通过蛋白质组学技术对中医药治疗脑卒中进行深入研究，可发现多种蛋白质、多靶标、多信号通路共同调节脑卒中的分子机制，这可为中医药起效机制的研究带来全新的思路，对临床治疗脑卒中具有重大意义[30-32]。

有研究表明，大黄及大黄为君的复方能针对“痰瘀交结，气血逆乱，腑气不通”这一缺血性中风与出血性中风在急性期的相同病机，有效治疗缺血性中风与出血性中风急性期[33]。Wang等[34]对生大黄和酒大黄治疗ICH大鼠模型的机制进行了蛋白质组学和代谢组学实验研究。结果显示，两种大黄治疗都能有效改善氧化应激和炎性反应。富集分析结果表明，与生大黄治疗的脑出血大鼠相比，酒大黄治疗可能调节氨基酸新陈代谢。生大黄治疗后的差异代谢产物分析和酒大黄治疗的大鼠相比结果显示，两种大黄治疗均抑制苯丙氨酸代谢，显示出神经保护作用。酒大黄与谷氨酰胺的代谢有关，这可能是它对ICH的治疗效果更好的可能机制之一。本研究为进一步探讨不同加工技术下大黄的治疗机制提供了基础，并促进了大黄作为一种治疗ICH药物的应用。

在我国，一些中药汤剂已被临床用于急性期ICH的临床治疗，其中大承气汤(DCQ)尤为重要。尽管DCQ已经使用了1800多年，但人们对它的神经保护机制知之甚少。揭示DCQ的治疗机制将有助于找到治疗ICH的关键因素。大黄是DCQ的君药。大黄素作为大黄中的一种天然活性化合物，已被证明具有脑保护作用。然而，大黄素的作用并不能完全代表DCQ的作用。因此，有必要系统地检测DCQ的作用，以探索其作用机制。Zeng等[35]的研究观察了DCQ和大黄素对ICH的保护作用及其可能的作用机制。结果显示，DCQ和大黄素均显著增加了M2小胶质细胞的数量，并对脑卒中后海马SND有保护作用。因此，抑制NR2B/MAPK和激活M2小胶质细胞是DCQ和大黄素提供保护作用的两个重要方面，在脑出血治疗中也尤为重要。与大黄素相比，DCQ显著改善了脑出血大鼠的神经功能缺损，增加了胶原酶-VⅡ注射后第7天开始的出血性病灶中小胶质细胞的数量。DCQ的特定活性成分及其特异性保护机制有待进一步研究。

3 多组学联合分析在脑卒中机制及治疗中的应用

目前，如何通过多组学联合分析的方式探讨疾病机制、预防、诊断，及药物治疗靶点的研究，是当前医学领域研究的热点，这对疾病的诊断、预防具有重要意义，也可为当前机制并不明确疾病治疗药物的开发提供新方向。在基于组学的研究方法中，蛋白质组学是发现新的生物标记物的最常用工具。然而，基因组学，转录组学和代谢组学分析的结果也是有益的，多组学方法可以实现优势互补，特别是多种组学方法应用于同一患者时。应用不同的组学技术进行多个数据集的联合分析对于阐明不同分子成分之间的关系至关重要。因此，通过整合分析多组学技术结合的结果，有望提高对脑卒中背后的分子动力学的理解。如因为不同的患者对静脉溶栓和再灌注的反应不同，预测治疗预后的生物标志物越来越重要，具体来说，预测出血性转化或识别有机会再次发生卒中的患者的生物标记物是有价值的。目前，多组学联合分析已经证明了出血性转化和基质金属蛋白蛋白水平增加之间的联系，且在微血管和血脑屏障的完整性中起着关键作用[36]。

4 小结与展望

随着医疗技术水平的不断提高、对脑卒中诊治认识的不断深入及百姓对本病防治观念的提升，我国脑卒中的死亡率已经大幅度下降。但仍有很多患者在急性期的救治(溶栓、抗血小板、控制血脂血糖等)后会遗留后遗症，如不同程度的言语不利、饮水呛咳。因此，如何早期识别、诊断并有效救治脑卒中具有重要意义。

4.1 中医药在防治脑卒中研究的展望 中医药在防治脑卒中方面具有独特优势，且随着现代中医的发展，干预方法逐渐丰富，基础研究日渐深入。脑卒中的诊治是一项需要多学科交叉配合协调的系统工程。国内中医药工作者对中风病的系统研究开展了三十余年，形成了《中风病诊断与疗效评定标准》，使其诊断及治疗走向规范，对脑卒中的科研及临床都起到了巨大的推动作用。虽然中医药在我国大规模用于治疗本病已有多年，但仍缺少高质量的临床试验说明其科学性，需要进一步开展高质量的临床及基础研究对其有效性、安全性进行验证。与此同时，新方法、新技术的参与对于本病早期预防与诊治也具有重要意义。对于中药干预原本因出血或缺血产生紊乱的差异蛋白的研究，可为其病因病机和中药疗效提供物质解释。

4.2 蛋白质组学在中医药领域研究中的展望 目前，蛋白质组学作为系统生物学的主要组成部分，在医学诊断、药物开发和机制研究等领域得到了广泛的关注，在疾病的预防、诊断和预后中正发挥着越来越重要的作用。蛋白质组学技术是阐明外周体液、细胞、组织、血液和尿液样本中蛋白质差异表达的重要研究工具。血液和尿液因它们的分子组成会随着身体的动态生理和病理条件而波动，成为蛋白质组学使用最广泛的标本。由于蛋白质是生物信息的主要执行者，蛋白质组学分析便直接反映了基因表达情况。利用蛋白质组学技术能让我们在蛋白质水平更深入地了解疾病；除了已知的危险因素之外，在组学水平上研究疾病新的危险因素和发病前患者的临床症状、体征、理化检查情况，对临床诊治和远期疗效具有重大的指导意义，这也与中医的“治未病”思想相契合，值得深入研究；此外，中药方剂由多种药物组成，每种药物还由多种化学成分组成。而一种化合物可以调节多种蛋白质。因此，蛋白质组学可能是最有效的确定有效蛋白质和解释潜在的药理机制的方法。如今，蛋白质组学也成为中医与现代生命科学的桥梁，极大地促进了中医的质量评价和标准化，促进了中医的现代化和国际化。但蛋白质组学在中药研究中的应用充满了挑战，蛋白质组学技术仍有待进一步完善。目前，与来自基因组学和转录组学的数据相比，从蛋白质组学技术中鉴定出的蛋白质相对较少；蛋白质组学的结果通常是不稳定的变量，这意味着蛋白质组学数据的重现性较差。为了获得理想的结果，需要结合其他的组学技术进行分析。

中医已在中国和其他亚洲国家被应用于疾病的诊断、治疗和预防3 000多年。由于中医诊疗概念的复杂性、技术的局限性，使中医诊疗缺乏客观的评价，中医理论的本质和作用机制尚不清楚。且中医的诊断和治疗主要依赖于中医医生的直觉和经验。与生物分子科学和西医相比，中医显得不客观及缺乏识别的准确性和可重复性。蛋白质组学有助于探索中医的科学内涵与中药现代化。首先，蛋白质组学可以用来识别不同的健康个体与不同中医证候患者的基因表达；其次，蛋白质组学可以帮助发现分子靶点，开发新的生物活性化合物，阐明中药治疗的潜在机制。因此，不仅是在脑卒中领域，从方剂的组成到中医基本概念(气、血等)的生物学基础，从病理到药理机制，蛋白质组学在中医学科很多方面的研究中都发挥了重要的作用。蛋白质组学分析确定的差异蛋白不仅为诊断提供了潜在的生物标志物，而且为更好地理解中医治疗提供了线索。更重要的是，这些发现有助于我们分析从古代文献中的抽象词中提取到的大量、重要信息，为新药的开发提供有价值的思路。但目前基于蛋白质组学研究的中医的大多数问题仍然很模糊，需要更多的研究来解决这些问题。例如，对中医证候的研究需要更多的临床数据，不同疾病之间相同的中医证候的概念有待于更直接的验证；需要对更多的穴位进行更多的临床研究来探求针灸的起效的机制；需要更深入、更系统的研究，以揭示中药处方活性成分之间的协同作用。此外，蛋白质组学与其他技术(其他组学、网络药理学等)之间的联用，对于全面了解目标问题至关重要。

蛋白质组学自身的发展也为中医药的发展带来了机遇。一方面，蛋白质组学作为一个独立的学科仍在发展中，如蛋白质基因组学的研究持续进展；另一方面，蛋白质组学技术在中医研究中的应用会不断上升和扩展，不仅在药理学研究领域，而且在不良反应和疗效评估等领域也大放异彩。同时，由于蛋白质组学技术的固有局限性，将蛋白质组学与其他组学和生物信息学进行整合联用也将成为研究趋势。