外泌体miRNA在妊娠期糖尿病发病中作用的研究进展

张秋雨，徐霞，颜建英

外泌体广泛存在于各种体液中，通过体液循环在细胞间传递物质和信息，参与人体多种生理和病理过程，已经成为早期预测和诊断疾病的重要生物标记物。随着高通量测序技术的发展，发现外泌体miRNA可以通过多种途径调节糖脂代谢、肝糖原代谢和胰岛素分泌等代谢，在妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)发生发展过程中发挥重要作用[1]。研究发现，在不同妊娠阶段，正常糖耐量(normal glucose tolerance，NGT)孕妇与GDM孕妇体液循环中外泌体miRNA的含量和生物活性均存在差异，推测外泌体miRNA含量或表达异常可能导致胰岛β细胞损伤和胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)，从而在GDM病理机制中发挥关键作用。

1 外泌体与外泌体miRNA

1.1 外泌体

外泌体是由细胞主动分泌的具有脂质双分子层膜结构的直径约为50～150 nm的微小囊泡，携带各种蛋白质、脂质、DNA和RNA(miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA)等物质，是一种几乎能被所有类型的细胞分泌的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。1983年，Pan BT等[2]在观察绵羊网织红细胞体外成熟的过程中首次观察到外泌体；1987年，Johnstone RM等[3]首次提出外泌体的概念，即外泌体是通过胞内噬菌体囊化并胞吐释放的微小膜泡。目前研究表明,所有哺乳动物细胞都能产生和释放外泌体，并广泛存在于尿液、乳汁、唾液和血液等各种体液中，证明外泌体是细胞间传递物质和信息的重要媒介，能通过直接融合、内吞、受体与配体结合等方式转移到对应的靶细胞或靶器官，参与细胞间通讯过程，调节机体内抗原呈递、免疫反应、肿瘤生长和细胞分化等生物过程，从而参与各种疾病的发生和发展[4-5]。

1.2 外泌体中的miRNA

miRNA是一类内源性的、长度约为20～24个核苷酸的非编码小RNA，存在于大多数生物体液中，并且比mRNA和蛋白质更稳定。miRNA主要是通过pre-mRNA的调节因子直接控制相关生物过程蛋白表达，在细胞生长、分化、程序性细胞死亡和脂质代谢途径的调节中发挥重要作用[6]。然而，研究发现体液循环中某些miRNA含量与对应胞外囊泡miRNA含量不同，显示外泌体miRNA是一种区别于血清总miRNA独立存在的生物标志物。2006年，有研究发现肿瘤细胞和干细胞来源的胞外囊泡携带的miRNA能影响受体细胞基因表达。Valadi H等[7]发现小鼠肥大细胞来源的外泌体miRNA在人类肥大细胞内正常表达，证明外泌体作为遗传信息载体能影响受体细胞内基因表达，为研究外泌体在生物体内的作用机制提供一个新方向。目前已经发现外泌体特殊膜结构能够保护其内部RNA免受酶降解，因此，外泌体内各种RNA较体液中RNA更为稳定，含量更高。外泌体miRNA进入靶细胞后可以直接与靶mRNA的3’端非编码区结合，抑制靶基因及其下游基因表达；也可以与lncRNA等“海绵”结合，发挥生理调节作用[8]。目前已经有越来越多关于外泌体miRNA在各种生物过程中作用机制的研究，随着量化和确定其成分特征的分析工具和技术的发展和完善，外泌体miRNA已经成为许多疾病诊断、预后和个性化治疗的重要生物标志物。

2 外泌体miRNA在GDM发病中的作用机制

GDM可能起源于特定的基因突变和/或胎盘激素调节失衡，在长期IR作用下胰岛β细胞受损，不能代偿调节血糖，是一种常见的妊娠期疾病。GDM将增加产后罹患2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)的风险，增加母儿大脑、肝脏等器官并发症的发生率。目前研究认为，胰岛β细胞损伤和IR是GDM的重要病理生理机制。许多学者已经证明外泌体miRNA在GDM胰岛β细胞损伤和IR中发挥重要作用，由于妊娠11周后就能检测到被释放到母体循环中的胎盘外泌体标志物，因此，临床期望通过检测外泌体miRNA从而早期诊断GDM[9]。

2.1 外泌体miRNA与胰岛β细胞损伤

大约70%胰腺细胞是胰岛β细胞，通过储存和分泌胰岛素调节葡萄糖代谢，维持血糖稳态，当胰岛β细胞不能释放足够胰岛素控制血糖浓度时，称为胰岛β细胞功能障碍。妊娠中晚期，机体抗胰岛素样物质增加，机体对胰岛素的敏感性降低，胰岛素需求量增加，胰岛β细胞功能障碍的孕妇胰岛素分泌受限，代偿失调导致血糖升高，使原有的糖尿病加重或出现GDM。胰岛β细胞损伤或功能障碍将促进GDM病情发展，出现高血糖和IR，从而导致胰岛β细胞功能障碍。

Zhang A等[10]研究表示，胰岛β细胞不仅可以分泌胰岛素，还能选择性地分泌miRNA， 通过外泌体介导调节胰岛素分泌、胰岛β细胞中的胰岛素信号通路和胰岛活性。Yoffe L等[11]研究发现，某些外泌体 miRNA 的富集可以调节GDM相关基因，有助于维持胰岛β细胞稳态，但长期暴露于高浓度的葡萄糖和脂肪酸将下调相关外泌体miRNA表达。Guay C等[12]研究发现，糖尿病小鼠T淋巴细胞来源的外泌体miRNA能够触发正常小鼠胰岛β细胞凋亡，促进募集免疫细胞，诱导自身免疫攻击，证明外泌体miRNA在免疫细胞和胰岛β细胞间通讯的重要作用。Xu H等[13]研究表明，miR-26a不仅通过自分泌调节胰岛素分泌和胰岛β细胞增殖，还能通过旁分泌调节外周胰岛素敏感性。Gesmundo I等[14]研究发现，炎症脂肪细胞与正常机体中生理脂肪细胞来源的胞外囊泡中miRNA表达存在差异，胰岛β细胞信号通路传导异常，影响胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌。Qian B等[15]研究证明，巨噬细胞通过介导外泌体miR-212-5p的细胞间转移，调节受体胰岛β细胞中的 Akt/GSK-3β/β-catenin 通路以限制胰岛素分泌，影响机体血糖调节。以上证明外泌体miRNA与糖尿病胰岛β细胞损伤和功能障碍密切相关。

2.2 外泌体miRNA在胰岛素抵抗中的作用

IR是指各种原因降低了胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，是靶细胞或组织对胰岛素敏感性或反应性降低的病理状态，易导致代谢综合征和糖尿病，主要发生于需要依赖胰岛素来利用葡萄糖的细胞，如脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞。虽然IR的确切原因尚未完全阐明，但有学者提出，可能与氧化应激、炎症、胰岛素受体突变、内质网应激和线粒体功能障碍等有关。分子层面上，IR可能与胰岛素信号转导障碍有关，导致葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的质膜转位不足，不足以将葡萄糖转入受体细胞。Catalano PM[16]研究发现，与正常妊娠相比，GDM患者胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率降低54%。

Ying W等[17]研究发现，miR-690是一种来自巨噬细胞外泌体携带的miRNA，在巨噬细胞炎症调节和胰岛素信号转导中发挥作用，能有效改善肥胖小鼠胰岛素敏感性。Pan Y等[18]研究表示，脂肪细胞分泌的外泌体miR-34a通过抑制M2巨噬细胞极化，促进肥胖引起的葡萄糖耐受、IR和全身炎症。Sun Y等[19]研究证明，胰岛β细胞内的外泌体miR-29通过促进机体单核细胞和巨噬细胞的募集和激活，调节全身炎症和葡萄糖稳态。Li J等[20]研究显示，胰岛β细胞释放的外泌体miR-29s能够抑制肝脏传导胰岛素信号，葡萄糖生成增加，能够调节肝脏对胰岛素的敏感性，控制葡萄糖稳态。Wu J等[21]研究证明，肝脏外泌体来源的miR-130a-3p通过抑制脂肪细胞中PHLPP2基因表达，调节脂肪组织能量代谢，减轻葡萄糖耐受不良。Li D等[22]研究发现，性腺白色脂肪组织来源的外泌体miR-222通过抑制IRS1表达以促进肥胖小鼠肝脏和骨骼肌的IR。Dang SY等[23]研究显示，脂肪组织来源的外泌体miR-141-3p可以介导肝细胞的胰岛素敏感性和葡萄糖摄取。Tian F等[24]研究显示，来源于脂肪组织巨噬细胞的外泌体miR-210通过靶向NDUFA4基因表达，调节葡萄糖摄取和线粒体活性，从而诱导糖尿病。Zhang Z等[25]研究发现，脂肪来源的外泌体miR-148能够通过调节内脏脂肪厚度减少GDM患病率。以上证明外泌体miRNA在IR病理过程中发挥重要作用。

3 外泌体miRNA在GDM临床应用的价值

近年来，越来越多研究表明，外泌体miRNA在健康孕妇和GDM孕妇体液中表达明显存在差异，且GDM及其相关并发症的发展过程存在阶段特异性。由于外泌体特殊膜结构，其携带的miRNA在组织和细胞中更稳定，较蛋白质更易提取，已有许多研究证明，外泌体miRNA预测和诊断GDM具有较高的敏感性和特异性。外泌体可作为一种新型纳米材料，输送miRNA抑制剂和激动剂用于GDM治疗，拥有更高的效率和靶向性，这是一种十分有潜力的GDM治疗措施。Lv Q等[26]利用电穿孔将miR-21-5p模拟物加载到人类脂肪干细胞(HASC)来源的外泌体中，发现外泌体miR-21-5p可促进糖尿病大鼠创面再上皮化、血管生成和胶原重塑，促进创面愈合。Shi R等[27]研究证明，糖尿病小鼠血液中荧光标记的外泌体可以携带miRNA穿过胎盘屏障，并可能在胚胎发育期间穿透胚胎心脏等器官或组织。提示可以利用外泌体miRNA降低糖尿病及其并发症的发生率。

然而，外泌体miRNA的临床应用还存在局限[28]。首先，外泌体的分离纯化技术还不成熟。目前，分离纯化胞外囊泡可以通过超高速离心、过滤、沉淀和免疫富集等方法，但均无法明显区分外泌体和其他胞外囊泡，将影响后续外泌体miRNA的体内外实验。其次，由于外泌体miRNA在患者血清中含量较低，在临床应用中缺乏高效收集的方法，限制了外泌体miRNA作为诊断和治疗的标志物在临床上应用。第三，需要进一步研究外泌体miRNA特异性，以确定其是否与一种或多种疾病相关，并探索外泌体miRNA在疾病中潜在的分子机制。第四，外泌体miRNA调控GDM的确切机制和具体作用有待进一步阐明。第五，开发基于外泌体的靶向药物运输系统比较困难。最后，尽管外泌体miRNA在许多糖尿病动物模型的治疗中发挥重要作用，但仍然缺乏临床试验来证实其准确性和安全性。

总而言之，利用外泌体miRNA治疗糖尿病仍然具有挑战性，进一步研究外泌体miRNA的功能和机制将为糖尿病的早期筛查、诊断和治疗提供新的方法。

4 总结

近年来，随着高龄孕妇的增多以及生活模式的改变，GDM的发病率逐年增加，临床能够诊断GDM时，孕妇已处于过长时间的高血糖状态，不利于GDM及其相关并发症的防治。目前研究认为，胰岛β细胞损伤和IR是GDM重要的病理生理机制，许多研究显示，外泌体miRNA在GDM胰岛β细胞损伤和IR中可能发挥重要作用。由于外泌体miRNA稳定存在于患者的血液、尿液和其他体液中，妊娠11周后即可在孕妇外周血中发现胎盘来源的外泌体，因此，临床期望能够通过对相关外泌体miRNA的检测从而早期诊断GDM，改善患者的预后效果。