饲料中黄曲霉毒素B1的检测方法研究进展

马利霞

（ 开封市畜产品质量监测检验中心，河南 开封 475004 ）

饲料及饲料原料霉变是一个全球性的严重问题，其产生的黄曲霉毒素危害极大。黄曲霉毒素一般来自黄曲霉和寄生曲霉，目前已知的黄曲霉毒素有20余种，主要分为B1、B2、M1、M2、G1、G2等形式[1]，化学分子结构相似，其中以黄曲霉毒素B1的毒性和致癌性最强。几种主要黄曲霉毒素的化学结构见图1。

图1 黄曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2的化学结构Fig.1 Chemical structure of aflatoxin B1、B2、M1、M2、G1、G2

黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，具有强致畸、致突变、致癌作用。一旦动物食用被黄曲霉毒素B1污染的饲料或饲料原料即可中毒[2]，并且其产生的副产物也含有黄曲霉毒素B1，可随着食物链进入人体和动物体内，危害机体健康，进而造成一定经济损失。许多国家、地区对黄曲霉毒素B1在饲料及饲料原料中的残留限量进行了严格规定。国内外有学者对饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B1的分析检测方法进行了大量研究，目前检测分为前处理和检测技术等两部分。本文对现有的黄曲霉毒素B1检测方法展开综述，为进一步研究黄曲霉毒素B1新的检测方法提供参考。

1 黄曲霉毒素B1的前处理方法

饲料及饲料原料种类多样、基质复杂，对黄曲霉毒素B1的准确定量造成了较大干扰；而黄曲霉毒素B1痕量、高毒，往往需要一定样品前处理技术将其从样品中分离、富集。目前，黄曲霉毒素B1常用的前处理方法主要有溶剂萃取法、柱层析法、免疫亲和柱法、固相萃取等方法[3]。

1.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法利用黄曲霉毒素B1易溶于极性有机溶剂中的特性，从而将其从基质中分离。饲料及饲料原料基质复杂，常使用几种有机溶剂的混合液提取样品中黄曲霉毒素B1。然而在提取溶剂时往往会掺入少量杂质，因此需接受相对应的净化处理，是任何操作不可缺少的第一步[4]。

传统的溶剂萃取法存在一定的局限性，无法准确地测定出饲料中残留的黄曲霉毒素B1。以此方法为基础进行创新优化生成了一些新的检测方法，如加压溶剂萃取法和分散溶剂微萃取法等，因溶剂萃取流程较为复杂，选择性较低，基质对此方法的影响较大，因而同样存在一定的局限性。

1.2 柱层析法

柱层析法是利用黄曲霉毒素B1在层析柱中利用液-液分配的原理进行提取，应用较为广泛。随着净化技术发展，已开发出专用的免疫亲和柱。免疫亲和柱是将黄曲霉毒素B1的抗体与活性固相载体结合制成层析柱，随着净化深入，黄曲霉毒素B1能够迅速地与免疫亲和柱的相关抗体进行有效融合，后经洗脱液脱附，完成样品的净化和浓缩富集[5]。尹安胤[6]采用免疫亲和色谱柱检测分析玉米中黄曲霉毒素B1，结果显示其加标回收率为88.5%～94.3%。现阶段，在饲料及原料曲霉毒素B1测定时，免疫亲和柱技术运用十分广泛，但是该技术存在制备复杂、抗体易失活且抗体价格昂贵等缺点。

1.3 固相萃取法

固相萃取法是凭借材料对组分具有独特的影响力，在试样溶液中能够轻松地保留下黄曲霉毒素B1，从而实现净化与富集的操作目的，在检测分析饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B1的前处理中广泛应用。王岩松等[7]选择免疫亲和富集黄曲霉毒素B1的固相萃取柱，对谷物中残留的黄曲霉毒素B1进行测定分析，结果显示，平均回收率为74.6%～89.6%，方法检出限达到0.1 ng/g。

2 黄曲霉毒素B1的检测方法

样品前处理技术将黄曲霉毒素B1从样品基体中分离且富集到合适的检测浓度，之后通过合适的方法进行检测。目前黄曲霉毒素B1检测方法有：色谱法、免疫分析法、电化学分析法、生物分析法等。

2.1 色谱法

色谱法是近年来饲料及饲料原料质量分析中最富活力的领域之一，利用待测物质中各组分在两相中吸附-溶解性的差异进行分配，最终将各组分区分开。色谱法具有分离效率高、分析速度快、样品用量少等优点，因而得到了广泛应用。色谱法主要包括薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法等。

2.1.1 薄层色谱法

薄层色谱法是早期应用最广泛的黄曲霉毒素B1分析技术，也是我国测定黄曲霉毒素B1的标准方法之一。在国标GB 5009.22—2016中规定，薄层板上黄曲霉毒素B的最低检出量为0.0004 μg，检出限是5 μg/kg，回收率75%以上。薄层色谱法的作用机制则是处于365 nm状态下时黄曲霉毒素B1可出现大规模的蓝色荧光，借助这一特性，基于具体样品选取适宜的溶剂萃取，再在薄层板上层析展开、分离，对荧光具体强度进行准确测定，并对比标准品，从而准确地计算出黄曲霉毒素B1含量。

随着样品纯化技术和分析仪器不断改进，使得该方法得到完善。Hoeltz 等[8]选择使用TLC+电感耦合检测器联合检测的方案检测花生中黄曲霉毒素B1，定量限设定为1.2 μg/kg，结果非常精准。Kotinagu 等[9]选择采用AOAC法对样品中的黄曲霉毒素B1进行提取，并使用高效薄层色谱法对其进行测定，设定了4个荧光法波长的状态，对其进行定量检测，所获取的结果同酶联免疫分析法完全吻合。薄层色谱法具有操作简单、检测迅速、检测费用低等优势，然而其样品前处理流程十分复杂，灵敏度较低，回收率与重复性差，不易完成自动化且样品中其他荧光物质易对检测结果造成干扰，在饲料及饲料原料中痕量黄曲霉毒素B1的分析应用受限，更适用于黄曲霉毒素B1的定性分析。

2.1.2 液相色谱法

液相色谱法广泛应用于黄曲霉毒素B1的检测工作中，包括高效液相色谱法以及液相色谱-质谱联用法。

2.1.2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法是第一个用于检测黄曲霉毒素B1的检测方法，也是目前应用较为广泛的一种方法。高效液相色谱法借助检测器分析黄曲霉毒素B1的含量，相关检测器较多，如荧光、紫外、二极管阵列等，涉及畜牧、化工和食品等多个行业[10]。潘迎芬等[11]利用免疫亲和层析净化-高效液相色谱法检测花生中黄曲霉毒素B1，其检出限为0.5 μg/kg，回收率在70%～110%之间，精密度好，与国标法相比，节省了大量前处理时间，有利于提高分析效率。此外，高效液相色谱法用于检测大米、饲料、大豆、鸡肝、鱼、虾等基体中的黄曲霉毒素B1均能够取得不错的结果。也有研究基于HPLC柱后衍生化构建了针对花生黄曲霉毒素检测的方法，并将其定量限制于0.11 μg/kg[12]。

高效液相色谱法的优势主要表现为检测快、灵敏度高、可用于大批量样品检测中，不超过25 min 便可获取检测结果，且能够回收与再次利用样品溶液和色谱柱。但这一检测方法所使用的仪器较贵，对检测人员的专业技能要求十分严格，推广难度大。

2.1.2.2 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用法则是借助液相色谱法的高分离效能、高选择性、可提供分子结构信息、前处理简单等优点，并利用质谱检测器对黄曲霉毒素B1检测的适用性，成为目前较先进的黄曲霉毒素B1检测方法[13-14]。

胡莎等[15]利用超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦中的真菌毒素，内标进行校正，黄曲霉毒素B1的检出限为0.5 μg/kg，定量限为1.5 μg/kg，加标回收率在86.6%～110.1%，该方法满足实验室日常检测。任宏彬等[16]采用液相色谱-串联质谱法对黄曲霉毒素B1进行测定，其检测值控制在70 ng/kg，回收率为85.0%～94.1%，相对偏差小于等于5.5%。

目前，液相色谱-质谱技术日益成熟，灵敏度得到有效提升，样品无须进行稀释，可有效预防净化环节中损失目标物的情况，不再依赖净化材料，检测投入费用相对有所降低。但这一检测方法在离化环节中基质的影响较明显，对黄曲霉毒素B1的定量准确度造成了影响，且仪器设备昂贵，检测成本高，操作步骤复杂，导致普及率不高。

2.1.3 气相色谱法

气相色谱法则是借助载气将气化样品输入色谱柱中，经过组分与固定的互相作用力之间的差异而实现分离。20世纪70年代，气相色谱法开始应用于霉菌毒素的检测。气相色谱法能够对霉菌毒素进行准确的定性分析[17]，且灵敏度高、检测限更低，但该法只适用于分离检测挥发性较大并且热稳定性较强的物质。但黄曲霉毒素B1挥发性差，在一定程度上限制了气相色谱法的应用。

2.2 电化学分析法

电化学分析法则是根据物质所具有的电化学特性与相关变化，定量、定性分析组分，目前有越来越多的新型电化学分析技术出现，并广泛应用于检测黄曲霉毒素B1的工作中[18]。

Mo 等[19]采用共价键结合的方法，将核酸适配体有效地固定于多孔阳极氧化铝纳米通道的表层中，对氧化石墨烯制备核酸适配体功能化的电化学传感器进行针对性修饰，并将检测黄曲霉毒素B1的测定范围控制在0.13 μg/L。Xiao 等[20]尝试采用核酸适配体修饰的毛细管电泳技术检测食品中的黄曲霉毒素B1，在1×10-8～1×10-4g/mL 线性范围内，能满足食品中痕量黄曲霉毒素B1 的测定。Xia等[21]则尝试把多孔纳米片作为荧光探针，以此为基础研发了基于磁性纳米颗粒的黄曲霉毒素B1免疫传感器，检测灵敏度、特异性高，检测限确定在0.002 μg/L；还尝试使用免疫分析技术对电化学传感器进行科学制备，准确地测定霉菌毒素。Nabok 等[22]使用偏振衍射仪，以此为基础研发了一种免疫传感器，并结合了平面波传导检测原理，检测限确定在0.01 μg/L。电化学分析法可高效率、精准地检测，且检测灵敏度高，但重复性差、检测器昂贵，广泛应用推广难度较大。

2.3 荧光光度法

黄曲霉毒素B1荧光光度检测技术根据黄曲霉毒素B1的荧光特性而研发，能够对黄曲霉毒素B1进行直接、高效率检测。其方法是提取甲醇，并对样品进行稀释与过滤处理，针对特异抗体对其予以免疫亲和柱层析净化，之后清除纯净水中的各种杂质，并借助甲醇对其进行洗脱处理，加入适量的溴，之后衍生并借助荧光光度计进行准确测定。荧光检测法检测费较低，操作便捷，无须同黄曲霉毒素B1的标准品进行对比，对检测人员的伤害较小，值得广泛推广。

2.4 免疫分析技术

免疫分析技术是基于抗原、抗体分子结合，形成抗原抗体复合物的分析方法，具有选择性、特异性、灵敏度高以及简便快速等优点[23]，包括酶联免疫吸附法、免疫层析法、免疫亲和色谱仪器结合测定法及荧光偏振免疫检测法等。

2.4.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫法选择在酶标板附上相关已知抗原，将酶标记抗体与样品进行有效混合，两者有效反应后再将多余的抗体洗净，添加适量酶底物，滋生出大量有色物质，再滴入终止液，反应停止，对抗原或抗体进行光度检测[24]。酶联免疫法可精准测量出黄曲霉毒素B1的具体含量，特异性相对较高，检测流程简单，结果分析比较简单。

王洁莲等[12]检测小米中的黄曲霉毒素B1时使用酶联免疫吸附法，检出限可达0.1 μg/L，回收率达75%以上。陈旭明等[25]利用酶联免疫吸附结合免疫亲和柱-高效液相色谱法检测大米中黄曲霉毒素B1，检出限为0.50 μg/kg，回收率为89.4%～95.2%，结合应用两种方法适用于大批量样品检测。近年来，酶联免疫法获得很大改进，建立了许多快速检测方法，如黄曲霉毒素B1试剂盒、黄曲霉毒素B1试纸等。马俊等[26]利用黄曲霉毒素B1-ELISA测试盒检测饲料中黄曲霉毒素B1的含量，结果显示，最低检出限为0.1 μg/L，黄曲霉毒素B1的含量在5.0～30.0 μg/kg 时，标准曲线的相关系数r=0.999 4，变异系数小于1%，回收率在94%～105.0%。酶联免疫法灵敏度高、特异性强，干扰物少，提取环节较为便捷，能够对大批量样品同时进行测定，且具有较高的回收率，值得广泛推广。但因为酶的活性受条件影响较大，测定结果稳定性差，易出现假阳性，分析结果准确性不高。

2.4.2 免疫层析法

免疫层析法是一种快速免疫分析技术，样品借助毛细作用在条状纤维膜上泳动，黄曲霉毒素B1与膜上特定区域的配体结合，通过酶促显色或直接着色标记。胶体金免疫层析以胶体金作为示踪标志物，对单克隆抗体进行精准标记，从而实现定性或定量检测。刘晓玥等[27]利用胶体金免疫层析法进行黄曲霉毒素B1的检测，结果显示，检出限为2.5 μg/L，该检测方法灵敏度高、效率高，精准度高达85%，能够在10 min内检测出样品中的黄曲霉毒素。

综上，免疫层析法较为便捷，特异性、灵敏度相对较高，环保效能感强，检测对象多，且比较实惠，可广泛应用于快速检测大批量样本工作中，使用前景十分可观，但实际操作中假阴性、假阳性的情况较为常见。

2.4.3 其他免疫法

放射免疫法则是通过准确地标记具有放射性同位素的标记物进行检测。标准品准确标记同素位，并完全同样品混合，添加特异性抗体对其放射情况进行精准呈现，准确计算抗原浓度。闫磊等[28]利用放射免疫法检测牛奶中的黄曲霉毒素B1，结果显示，检测限达到0.5 μg/kg。

荧光偏振免疫测定法通过标记荧光素测定黄曲霉毒素B1，相关研究相对较少[29]。荧光标记的黄曲霉毒素B1与样品中的黄曲霉毒素B1能够与适量的抗体进行竞争融合平衡相关反应，表明荧光标记的黄曲霉毒素B1与样品的浓度呈反比[30]。

时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）是一种最新的检测方法，主要应用于超微量检测，灵敏度高达10～19，可借助免疫反应的高度特异性以及标记示踪物的灵敏性进行融合。TR-FIA 的标记物离子能够出现大量荧光，其荧光不仅具有较高的强度，且衰变时长相对较高，待测样品中寿命相对较短的自然荧光出现衰变趋势后，对其离子荧光进行测定。TR-FIA 在黄曲霉毒素B1的检测前景较广，但难以实现自动化，且整个合成抗体的过程较为繁杂，费用相对较高，往往需要使用高科技仪器，不利于该技术在黄曲霉毒素B1检测领域的发展和应用。

3 展望

目前饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B1的检测方法种类较多，但各具优缺点。饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B1检测技术备受关注，日益成熟，且不断地调整与优化相关法律法规及标准，有效地保障食品的安全性，需联合使用各种检测方法，以此获得精准的数据。今后黄曲霉毒素B1的检测方法主要的发展趋势有：研发新型高选择性材料，改进黄曲霉毒素B1的前处理过程。液相色谱-质谱联用技术的应用越来越广，可有效地控制检测费用，加快检测效率，符合相关监管机构的检测要求。